温度和盐度对马氏珠母贝精子激活率及活力的影响

采用中心组合试验设计(CCD)和响应曲面法,在实验室条件下研究温度(T)、盐度(S)对马氏珠母贝(Pinctada martensii)精子激活率及活力的影响并建立了模型。实验设置的温度范围为15～45℃,盐度范围为12～48。结果表明,马氏珠母贝精子激活率与活力随着温度、盐度的升高呈先升高后降低的趋势;盐度的一次效应和二次效应以及温度的二次效应对精子激活及活力的影响极显著(P<0.01),温度和温盐的互作效应对精子激活率及活力的影响不显著(P>0.05);保持马氏珠母贝精子激活率较高时的温度为26～31℃,盐度为25～30;保持马氏珠母贝精子活力较大时的温度为24～35℃,盐度为22～30;实验建立了温度和盐度对马氏珠母贝精子激活率及活力影响的模型,通过模型同时优化得出温度30.04℃,盐度为26.86时,马氏珠母贝精子激活率最高、活力最大,分别为85.51%和57.82%。

马氏珠母贝TLR6基因的克隆、序列分析与表达

为了探究TLR6(Toll like receptor 6)在马氏珠母贝免疫反应中的作用,实验采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术获得了马氏珠母贝TLR6基因(Pm-TLR6)c DNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了Pm-TLR6在马氏珠母贝各组织中的表达情况、哈维氏弧菌刺激后和植核移植后血淋巴中的表达模式。结果显示:Pm-TLR6c DNA全长2295 bp,其中5′非编码区(UTR)长94 bp,3′UTR长89 bp,开放阅读框(ORF)长2112 bp,编码703个氨基酸;多序列比对结果表明物种间TLR6具有较高的保守性;PmTLR6具有跨膜域、富含亮氨酸的重复序列(LRRs)和TIR域,符合TLRs家族特征。q RTPCR数据分析表明,Pm-TLR6在马氏珠母贝肝胰脏、血细胞、鳃、性腺、闭壳肌、外套膜中均有表达,其中肝胰脏中表达量最高;哈维氏弧菌刺激后,Pm-TLR6在2 h表达上调,约为对照组(0 h)的9倍,随后的6 h恢复至正常水平,直至16 h表达水平开始回升并于24 h达到最大表达量,是对照组的29.4倍,具有显著性差异;植核移植实验结果显示PmTLR6在植核后5和10 d表达水平没有显著性变化,15和20 d表达量出现上升趋势,但差异不显著,最后于30 d达到最大值,约为空白对照组(0 d)的5倍,具有显著性差异。研究表明,Pm-TLR6可能在马氏珠母贝免疫防御反应中担任着重要的角色。

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)Pm-HK基因的克隆及其对温度胁迫的响应

己糖激酶(hexokinase, HK)是糖酵解过程中的首个限速酶。本实验利用RACE技术克隆获得了马氏珠母贝HK (Pm-HK)基因,并对其基因和氨基酸序列结构特征进行了生物信息学分析,同时采用荧光定量PCR技术分析了该基因在不同组织的表达模式及不同温度下的时序表达模式。序列分析表明,Pm-HK cDNA序列全长为2 403 bp,其中开放式阅读框1 548 bp,5'UTR 74 bp,3'UTR 781 bp,共编码515个氨基酸,分子量为57.67 kD,理论等电点为6.08。结构域分析发现Pm-HK具有两个完整的保守功能域Hexokinase_1、Hexokinase_2,以及两个Glucose-6-Phosphate结合位点、三个Glucose结合位点,两个ATP结合位点。多序列比对结果表明Pm-HK与太平洋牡蛎HK同源性最高,为81%;系统进化分析发现,Pm-HK与太平洋牡蛎等贝类HK聚为一支。组织表达定量分析结果显示,Pm-HK在马氏珠母贝肝胰腺中显著高表达;对不同温度下鳃组织中Pm-HK的时序表达分析发现,在处理12 h后各时间点低温组(12℃) Pm-HK基因表达水平最高,且均显著高于中低温组(17℃)、对照组(22℃)和高温组(32℃)。以上结果表明Pm-HK可能参与马氏珠母贝的低温胁迫响应。该研究为进一步探索Pm-HK在马氏珠母贝在温度适应性中的作用提供了基础资料。

马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii）新型清道夫受体基因克隆与表达分析

清道夫受体（scavenger receptors,SRs）作为一类先天性免疫受体,在宿主固有免疫防御中起着重要的作用。本研究采用RACE技术首次从马氏珠母贝c DNA文库中克隆出一个新型的马氏珠母贝SR基因全长序列（pmSR）,并且运用qRT-PCR技术检测了pmSR基因在马氏珠母贝不同组织中的表达情况和哈维氏弧菌刺激后在血淋巴中的时序表达模式。结果显示,PmSR基因序列全长为954 bp,5＇UTR长为107 bp,3＇UTR长为169 bp,开放阅读框为678 bp,其编码225个氨基酸;PmSR氨基酸序列含有α卷曲螺旋结构和具有6个保守的半胱氨酸的SRCR域（scavenger receptor cystein rich domain）,具有A型SRCR结构域的典型特征。SRCR结构域氨基酸序列多序列比对显示Pm SR的SRCR结构域与老鼠和斑马鱼MARCO（macrop Hage receptor with collagenous structure,MARCO）SRCR相似度最高,分别为44%和43%;且蛋白质聚类分析表明PmSR与SR-AI（class A scavenger receptor I,SR-AI）同源性最高。qRT-PCR结果显示,PmSR基因在马氏珠母贝闭壳肌、肝胰腺、血细胞、外套膜、性腺、鳃中均有表达,在肝胰腺表达量最高;哈维式弧菌（Vibrio harveyi）刺激后,血淋巴中PmSR基因表达量在0-8 h逐渐上升,并于8 h达到最大表达量,约为对照组（0 h）的4.2倍,表达量随后下降,直至16 h后,其表达量再次出现显著性上升,结果具有显著性差异（p〈0.05）。本研究为贝类免疫防御系统的研究提供了重要资料。

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)PmHEX基因的功能研究

几丁质是软体动物贝壳有机框架的重要成分,其代谢在贝壳矿化中发挥重要作用。β-N-乙酰-己糖胺酶(HEX, EC3.2.1.52)是几丁质代谢的关键水解酶。为了探究马氏珠母贝β-N-乙酰-己糖胺酶(Pm HEX)(登录号:MF555152)在贝壳形成中的作用,本研究利用原位杂交(ISH)技术检测Pm HEX基因在外套膜的定位,结果显示Pm HEX的mRNA主要分布于外侧褶的外上皮细胞、中褶的内侧上皮细胞和内褶上皮细胞。利用RNAi技术抑制Pm HEX表达后,Pm HEX在边缘区和套膜区的表达量均显著下调;SEM观察发现实验组的棱柱层和珍珠层的微观结构都出现不同程度的紊乱。综上所述,Pm HEX可能通过影响几丁质代谢,参与马氏珠母贝贝壳棱柱层和珍珠层的矿化过程。

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)PmHEXL基因的分子特征与表达分析

几丁质作为有机框架主要成分参与贝壳的形成。β-N-乙酰-己糖胺酶(Beta-hexosaminidase/Beta-N-acetylhexosaminidase, HEX)属于糖苷水解酶家族20,在几丁质水解过程发挥重要作用。为了探究Pm HEXL在马氏珠母贝贝壳形成中的作用,本研究利用RACE技术克隆获得Pm HEXL基因c DNA全长序列并检测其在不同组织的表达模式。研究显示,Pm HEXL基因序列全长2 760 bp,其中5'UTR为167 bp,3'UTR为268 bp,开放阅读框(ORF)为2 325 bp,编码774个氨基酸;预测其相对分子量为89.59 kD,理论等电点为5.93;SMART软件分析PmHEXL蛋白质序列,发现它具有典型的GH20、GH20b结构域和CHB-HEX结构域;多序列比对结果显示Pm HEXL与其它物种的HEX具有较高的保守性;qPCR表达分析显示Pm HEXL在外套膜套膜区表达量最高,边缘区次之。综上所述,Pm HEXL可能参与马氏珠母贝贝壳的形成过程。

合浦珠母贝海洋酸化和温度胁迫下基因共表达网络分析

利用共表达网络分析法(WGCNA)筛选出合浦珠母贝外套膜在高温胁迫下影响显著的1个响应基因模块和海水酸化胁迫下的5个响应基因模块,并对模块中包含的基因进行功能富集;分析贝壳蛋白与模块其他基因的关联性,构建矿化基因的应激网络。高温显著响应模块基因富集结果显示细胞骨架蛋白发生了显著的变化,如ARHGEF4、SAP和myosin。酸化应答模块共5个,响应的基因包括呼吸相关的血红素A合成酶、芳香族氨基酸代谢相关的酶、钙粘蛋白和血小板反应蛋白等。另外,高温应答模块聚集了最多矿化基因,包括MSI、Tyrosinase、Fibronectin-like protein等重要的矿化基因,说明这些矿化基因对温度较为敏感。构建基因共表达网络的结果显示钙离子结合蛋白、细胞骨架蛋白、蛋白质糖基化相关的基因关系密切。

马氏珠母贝Pm-vasa基因的克隆与表达分析

vasa蛋白是DEAD-box家族蛋白的一员,在真核生物原生殖细胞形成过程中起关键作用。本实验利用RACE技术克隆获得了马氏珠母贝vasa基因(Pm-vasa),并对其结构和组织表达模式进行了分析。结果表明:Pm-vasa c DNA序列全长为1 709 bp,其中开放式阅读框1 431 bp、5'UTR 148 bp、3'UTR 131 bp,共编码476个氨基酸,分子量为52.139 k D,理论等电点为6.24。SMART软件分析显示Pm-vasa蛋白具有典型的DEAD-box结构域,且具DEAD-box家族蛋白9个典型保守基序。多序列比对结果表明Pm-vasa与紫贻贝vasa同源性最高,为74%;系统进化分析发现,Pm-vasa与紫贻贝等软体动物聚为一支。组织表达定量分析发现Pm-vasa基因m RNA在性腺中显著高表达。我们的研究结果表明Pm-vasa可能参与马氏珠母贝的性腺发育。

马氏珠母贝TLR13基因的克隆与组织表达分析

TLR13（Toll like receptor 13）是一种TLR模式识别受体,属于TLR11家族,在机体抵抗细菌、真菌、病毒和寄生虫的感染过程起重要的作用。为研究马氏珠母贝TLR13（PmTLR13）在马氏珠母贝免疫反应中的作用,本研究采用RACE扩增技术获得了PmTLR13基因cDNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术检测PmTLR13基因在马氏珠母贝7个组织中的表达模式。结果显示,Pm TLR13基因序列全长2 750 bp,其中5＇UTR长为25 bp,3＇UTR长为34 bp,开放阅读框（ORF）为2 106 bp,编码701个氨基酸,预测其分子量约为81.22 kD,等电点为8.77。SMART分析结果显示PmTLR13具有富含亮氨酸的重复序列（LRRs）、TIR域、跨膜域和信号肽,符合典型的TLR家族特征;多序列比对结果表明物种间TLR13具有较高的保守性;RT-PCR数据分析表明,PmTLR13基因在马氏珠母贝肝胰腺、性腺、闭壳肌、鳃、血细胞、中央膜区、边缘膜区中均有表达,其中鳃中表达量最高,其次是外套膜边缘区和肝胰腺。研究结果表明,PmTLR13可能在马氏珠母贝免疫防御反应中担任着重要的角色。

马氏珠母贝DcpS基因的分子特征与表达分析

清道夫脱帽酶(DcpS)是一种mRNA脱帽酶,与基因表达调控、呼吸、运动神经元活动,癌症和各种应激反应紧密相关。本研究采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得了马氏珠母贝DcpS(Pm Dcp )基因cDNA全长序列;运用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术检测Pm DcpS基因在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。结果显示,Pm DcpS基因序列全长1 034 bp,其中开放阅读框(ORF)为975 bp,编码324个氨基酸,5'非编码区(5'UTR)长为25 bp,3'非编码区(3'UTR)长为34 bp,包含29 bp的poly A。预测分子量约为37.94 k D,理论等电点为6.12。序列分析发现Pm DcpS具有典型DcpS结构域。多序列比对结果表明物种间DcpS具有较高的保守性,与太平洋牡蛎的相似性为65.6%。实时荧光定量PCR数据分析表明,该Pm DcpS基因在马氏珠母贝性腺、鳃、肝胰腺、血细胞、闭壳肌、外套膜边缘区、外套膜中央区这7种组织中均有表达,其中在外套膜中央区和肝胰腺表达量较高。本研究可为进一步探究Pm DcpS在贝类中的生物学功能提供重要的理论基础和参考价值。