三叶半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit)的间歇浸没培养

目的:利用间歇浸没培养反应器对药用植物三叶半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit)进行组培快繁研究。方法:以增殖倍数、鲜重、平均鲜重、折干率和组培苗状态为指标,一方面对三叶半夏叶片、叶柄及丛生芽体进行培养,考察适合间歇浸没培养的外植体类型;另一方面以叶柄为外植体对三叶半夏进行间歇浸没培养、固体培养和液体摇瓶培养,考察三种培养方式对其生长的影响。结果:不同的外植体在反应器内培养时,从增殖情况来看,丛生芽作为外植体得到的增殖倍数高达39.15,叶柄为27.65,叶片为18.05。鲜重方面与增殖倍数具有相同的规律。从平均鲜重和折干率来看,无显著差异。由组培苗形态来看,以叶柄诱导的组培苗最为健壮,而以丛生芽诱导的组培苗则较为细弱。不同培养方式下的增殖倍数分别为:间歇浸没培养方式最高为24.73,其次固体培养为14.75,液体摇瓶培养为12.26,差异显著。平均鲜重和折干率均为间歇浸没培养最优。由组培苗形态来看固体培养优于间歇浸没培养,反应器得到的组培苗较为细弱。在保卫细胞长宽和叶绿体个数上两者没有显著性差异。而液体摇瓶培养玻璃化导致叶绿体个数减少,不适合培养三叶半夏的。结论:较适合间歇浸没培养的外植体类型为叶柄和丛生芽,以叶柄为优。间歇浸没培养方式相对于传统的固体和液体培养在各项生理指标上表现较好,具有大规模培养三叶半夏的潜力。

利用组培技术构建半夏杂交体系

本研究通过构建半夏品系的杂交体系并研究杂交种苗的扩繁周期,以解决半夏自然杂交成功率低、杂交种苗繁育效率低的问题。对消毒过的半夏花粉和雌蕊以TTC法测定其活力,并通过对比实验确定雌蕊的最佳培养基,对3种新的半夏品系持续培养出F_(1)代杂交苗,通过杂交苗继代探究转接周期和成苗周期。结果表明,半夏雌蕊和花粉的最佳消毒时间为6 min;雌蕊的最佳培养基配方是半糖无琼脂MS培养基20.00 g/L+蔗糖15.00 g/L+琼脂5.00 g/L+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.01 mg/L,pH=5.8。以此为基础,培育出F_(1)代苗;4种半夏品系的F_(1)代杂交苗与亲本组培苗叶型有明显区别,经过扩繁发现了两个杂交种苗的扩繁周期。本研究建立了基于植物组织培养技术的半夏杂交体系并获得杂交苗,并探明杂交种苗的繁育周期。

Fe元素对半夏试管珠芽形成及试管苗生长的影响

为选出培养半夏试管珠芽的适宜Fe^(2+)浓度,该研究通过梯度改变1/2MS基本培养基中Fe^(2+)浓度,依据试管珠芽的形成时间、诱导率,试管苗地上、地下形态指标,试管珠芽中淀粉粒数量与分布,叶片叶绿素含量及试管珠芽有效成分含量等指标,得出试验结果为9.2×10^(-5)mol·L^(-1)浓度下各项指标最佳。此外,还发现Fe缺素下无法形成完整试管珠芽,说明Fe是半夏试管珠芽形成过程中必不可少的微量元素,但同时浓度不宜过高,因高浓度Fe^(2+)下,形成的试管珠芽极小且后续无法正常萌发成苗。

半夏开花物候与结实特征分析

为深入理解半夏独特的开花物候特征和生殖特性,对半夏花的形态学特征、个体开花散粉习性、居群开花物候及结实特征进行了统计分析。结果表明,半夏群体开花规律呈单峰型,花期集中在5月下旬到6月下旬,花期长约58 d;半夏开花与散粉的日变化规律均呈倒单峰型,开花高峰期为7:00—11:00,而花药散粉高峰期为7:00—9:00;散粉持续时间为47.22 h,个体花期持续时间、花序开放进程、花序开花持续时间和种群花期历时分别为18、13、5.3、51.5 d;花序开放进程与花序开花持续时间分别以14 d和6 d出现的频率最高。半夏花不具虫媒、风媒花特征,传粉完全依靠花粉的自然散落,这可能是其结实率低的主要原因;进一步相关性分析发现,始花时间分别与开花率和结实率存在显著负相关关系,花期长度和开花率分别与结实率呈极显著正相关;开花率、结实率与半夏个体的块茎大小密切相关。综上,人工辅助延长半夏的花期和提高开花率有助于提高其结实率,进而提高有性繁殖效率。

半夏提取液对大豆蚜虫生物活性及活性剂量的初步筛选

以半夏的球根茎为试材,基于均匀设计法研究了半夏球根茎的不同提取液对大豆蚜虫的触杀和拒食作用。结果表明:乙醇浸提液对大豆蚜虫具有较高的触杀作用。水蒸气蒸馏液对大豆蚜虫具有较强的拒食作用。乙醇浸提液对大豆蚜虫48h的致死中浓度(LC50)为9.7439g/L,水蒸气蒸馏液对大豆蚜虫24、48h的拒食中浓度(AFC50)分别为8.3756、7.9162g/L。丙酮浸提液对大豆蚜虫的触杀和拒食作用不显著。半夏球根茎的乙醇浸提液和水蒸气蒸馏液对大豆蚜虫54h的同时触杀和拒食活性质量浓度初步筛选结果表明:乙醇浸提液24.1955g/L和水蒸气蒸馏液23.0230g/L联合使用对大豆蚜虫同时触杀和拒食活性作用最好,死亡率达100%。

半夏药材中蛋白质IEF电泳图谱的研究

目的通过对半夏及其近缘植物的蛋白质电泳图谱比较,研究半夏药材的电泳鉴别方法。方法应用等电聚焦(isoe lectrofocus ing,IEF)技术,对不同产地半夏及其近缘植物块茎进行比较。结果半夏具有稳定的IEF电泳图谱,显示具有8条特征蛋白质带,并测定了其等电点(P I)值,半夏与其几种近缘植物的IEF谱有明显的区别。结论半夏IEF电泳图谱可作为半夏药材的鉴别依据,半夏特征蛋白质的P I值为半夏的鉴定和蛋白质分离纯化提供了参数。

半夏转录组中的SSR位点信息分析

目的：分析半夏转录组中的SSR位点信息,并设计SSR引物,为开发新的分子标记奠定基础。方法：利用EST-trimmer和cross-match对转录组测序获得的unigene进行过滤,除去冗杂序列;利用MISA对无冗余unigene进行SSR搜索。结果：从搜索序列中发现14 468个SSR,分布于12 000条unigene中,出现频率为16.24%,分布密度为1/4.33 kb。二核苷酸和三核苷酸是主要重复类型,分别占SSR总数的51.15%和41.50%。AG/CT和CCG/CGG分别是二核苷酸和三核苷酸的优势重复基元,分别占41.54%和11.84%。87.14%的基序长度集中在12-20bp。结论：半夏转录组SSR位点出现频率高、类型丰富、密度大、多态性潜能较高,在半夏遗传多样性研究、分子标记辅助育种、遗传图谱绘制等方面具有很大的应用潜力。

遮荫对半夏叶片光合色素与保护酶活性的影响

对半夏进行不同程度遮荫处理,研究了其生长过程中叶组织的光合色素含量、叶绿素a/b值、保护酶体系(SOD、POD、CAT)活性和丙二醛(MDA)含量的变化及其生理特性.结果表明:不同处理的半夏在生长过程中,光合色素的含量呈先升后降的趋势;与全光照相比,遮荫处理的叶绿素含量较高,叶绿素a/b值较低,类胡萝卜素含量在生长发育中早期较低而后期较高;SOD、POD、CAT活性呈由低到高再降低的趋势,MDA含量持续升高;遮荫处理的SOD、POD活性和MDA含量均低于全光照处理,CAT活性则表现为先高于后低于全光照处理.适度的遮荫可以提高半夏叶绿素的含量,降低膜系统受到的伤害,改善半夏的倒苗状况,为半夏叶片的生长提供较好的环境.

RP-HPLC法同时测定半夏中5种核苷含量的研究

目的:采用反相高效液相色谱法检测半夏药材中的核苷类成分,同时对检测确定的5种核苷进行含量测定。方法:核苷检测采用3种色谱条件,通过与对照品的对照,确定在半夏中5种核苷分别为尿嘧啶、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷。含量测定采用 Ace C_(18)柱(150mm×4.6mm,5μm),以水为流动相,流速:0.8mL·min^(-1),测定波长254nm。结果:尿嘧啶、黄嘌呤为首次在半夏中检测到。尿嘧啶、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的线性范围依次为0.82～8.16,1.52～15.24,3.30～33.04,0.50～5.02,2.98～29.84μg·mL(-1)。r=0.9995～0.9999;回收率:96.4%～102.3%。结论:以 RP-HPLC 法同时测定半夏药材中的5种核苷快速、简便,结果可靠,为测定半夏中核苷类成分提供了有效的方法。

遮荫对半夏生物学特性的影响

对山西产半夏进行了盆栽试验,研究其在全光照和遮荫处理下的生物学特性。结果表明,半夏是喜阴植物,遮荫55%和80%与全光照相比,叶长、叶宽、株高分别增加了38%和27%,8%和25%,59%和101%;叶片的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量分别增加了17%和26%,28%和36%,10%和13%,叶绿素a/b减小;半夏的珠芽数量与鲜重分别增加了215%和101%,177%和56%。综合分析认为,遮荫55%可为半夏生长发育提供较适宜的环境条件,对珠芽数量和质量及半夏总产量的提高有重要意义。

半夏化学成分的分离与鉴定

目的研究半夏乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分,对其中的化学成分进行分离鉴定。方法采用硅胶、Sephadex LH-20柱色谱以及制备型高效液相色谱等手段进行分离纯化,通过理化性质和各种波谱技术对化合物进行结构鉴定。结果从半夏的乙酸乙酯萃取部分分离得到10个化合物,分别鉴定为环-(苯丙氨酸-酪氨酸)[cyclo-(Phe-Tyr),1]、环-(亮氨酸-酪氨酸)[cyclo-(Leu-Tyr),2]、尿嘧啶脱氧核苷(2′-deoxyuridine,3)、(+)异落叶松脂醇9-O-β-D-葡萄糖苷[(+)isolaricires-inol9-O-β-D-glucopyranoside,4]、(+)异落叶松脂醇[(+)isolariciresinol,5]、尿嘧啶(uracil,6)、没食子酸(gallic acid,7)、尿苷(uridine,8)、腺苷(adenosine,9)、环-(缬氨酸-酪氨酸)[cyclo-(Val-Tyr),10]。结论化合物1、3、4为首次从半夏属植物中分离得到,化合物2、7、10为首次从半夏中分离得到。

半夏珠芽萌发动态及其影响因子的研究

目的研究半夏P inellia terna ta珠芽的萌发动态及其影响因子,为阐明半夏珠芽的生产应用和珠芽发育生物学提供依据。方法利用完全随机实验设计研究半夏珠芽的萌发动态以及珠芽大小、不同覆土深度、土壤干湿度和不同来源对半夏珠芽萌发和半夏生长的影响。结果四川南充半夏珠芽播种约14 d开始萌发,23 d萌发率达60%以上,29 d完成萌发。直径≥8 mm的珠芽的萌发率显著高于5 mm≤直径<8 mm的珠芽;两种覆土深度10和20 mm对半夏珠芽的萌发和半夏幼苗的生长没有显著性影响;保持土壤湿润的珠芽萌发率显著高于土壤见干见湿的珠芽;从播种到23 d时,四川南充半夏的珠芽萌发率极显著高于山西新绛半夏的珠芽,随后二者的萌发率没有显著性差异。另外发现不同来源的半夏珠芽在萌发时叶形会发生变化。结论培育大的珠芽对半夏繁育有重要意义,保持土壤湿度对提高萌发率和促进半夏幼苗生长有重要作用,不同来源的半夏珠芽具有不同的萌发特点和生长特性,应重视半夏不同品系的筛选。

半夏种内不同居群酯酶和超氧化物歧化酶同工酶酶谱特征分析

对栽培在同一生境下的 16个半夏〔Pinelliaternata (Thunb .)Breit.〕居群同一生长期叶片中酯酶 (EST)和超氧化物歧化酶 (SOD)同工酶酶谱进行了比较分析 ,结果表明 :EST和SOD同工酶酶谱在各居群间 ,甚至在同一居群内除少数共有的特征谱带外存在着较为明显的频率差异。EST同工酶在半夏各居群中最多可显示 12条谱带 ,其中在慢区的第 5 (弱带 )和快区的第 10 (强带 ) 2条谱带为各居群所共有的特征谱带 ;SOD同工酶在半夏各居群中最多显示 9条谱带 ,其中在慢区的第 2 (弱带 )、快区的第 5 (强带 )和第 9(强带 )

半夏及其毒针晶刺激性毒性的稳定性研究

目的:考察半夏毒针晶刺激性毒性的稳定性及针晶蛋白对针晶刺激性毒性的贡献,为进一步揭示半夏毒针晶产生刺激性毒性的机制提供依据。方法:不同溶剂及混合蛋白酶液浸泡处理半夏及其毒针晶,用家兔眼结膜刺激性模型考察半夏及其所含针晶的刺激性变化,用电镜扫描法观察毒针晶晶体结构变化,采用垂直凝胶电泳(SDS-PAGE)试验分析蛋白酶液浸泡前后针晶蛋白的条带变化。结果:半夏毒针晶在甲醇、乙醇浸泡24 h内刺激性逐渐消失,半夏生品在75%乙醇溶液润制2 d后刺激性降低,扫描电镜显示经过甲醇、乙醇处理的毒针晶变得易于断碎,针尖锈蚀。混合蛋白酶液浸泡3 min后的半夏毒针晶刺激性急剧下降,SDS-PAGE图谱显示蛋白酶液浸泡后的针晶蛋白被酶解。结论:半夏针晶蛋白对针晶刺激性有贡献。甲醇、乙醇浸泡可使半夏毒针晶刺激性下降,提示可能是由于极性有机溶剂作用于针晶蛋白,逐渐破坏针晶蛋白的功能。

紫外分光光度法测定不同产地半夏中总生物碱的含量

目的 :测定不同产地半夏中总生物碱的含量 ,比较相互差异。方法 :对半夏药材采用超声提取 ,依据酸性染料比色法的原理 ,在 4 16nm波长下进行比色测定药材中总生物碱。结果 :获得良好的线性关系 (r =0 .9998)和回收率 (10 2 .0 2 % ) ,RSD为 2 .38%。样品在 5 h内基本稳定 (RSD为 0 .32 35 % )。结论 :测定方法简单快速 ;不同产地半夏总生物碱含量有一定差异 。

半夏药材HPLC指纹图谱研究

目的:建立渝产半夏的指纹图谱,为半夏药材的质量控制提供依据。方法:采用HPLC法,cosmosilODS(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,流动相以甲醇-水(0%～5%)连续梯度洗脱,检测波长254nm,流速1.0ml/min,进样量20μL,柱温25℃。结果:建立了6种叶型性状类型半夏的指纹图谱。半夏药材有11个共有峰,多数峰可以达到较好分离。各栽培半夏间共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.1%,相对峰面积RSD均小于1%,符合指纹图谱相关要求。结论:建立的HPLC指纹图谱有较好的精密度、重现性和稳定性,可以作为半夏质量评价主要依据之一。

半夏的病毒危害及脱毒快繁技术研究

目的确定病毒病对半夏植株生长的危害,通过组织培养手段对病毒进行脱毒技术研究.方法采取高温钝化结合茎尖培养的方法,用多种激素诱导茎尖成苗、长根及增殖等.结果用6-BA 1.0～2.0 mg/L、NAA 0.2mg/L诱导成苗可有效地脱去病毒;6-BA 2.0 mg/L附加适量的NAA和GA3可促进珠芽增殖及试管苗的生长速度;IAA 0.2～0.5 mg/L可促进半夏根系的发育;6-BA 2.0 mg/L、GA3 0.2 mg/L配以适当质量浓度的2,4-D和NAA可促进叶片愈伤组织形成丛生苗.结论对半夏病毒病的脱毒率达到80%,脱毒植株叶片的内部结构排列有序、清晰可见.

半夏中抑制肿瘤坏死因子-α产生的新脑苷

目的研究半夏Pinellia ternata鲜块茎中的生物活性成分,为其质量评价提供科学依据。方法采用多种柱色谱方法分离纯化,根据理化性质和谱学方法鉴定结构。采用MTT法,体外观察化合物对脂多糖(LPS)刺激的小鼠腹腔巨噬细胞产生肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的抑制作用。结果分离得到8个化合物,分别鉴定为环阿屯醇(I)、β-谷甾醇(Ⅱ)、α-棕榈精(Ⅲ)、胡萝卜苷(Ⅳ)、异半夏苷(1-O-β-D-吡喃葡糖基-(2S,3R,4E,11Z)-2-[(2R-羟基十六碳烯酰基)氨基]-4,11-十八碳二烯-1,3-二醇,V)、胡萝卜苷-6′-O-二十烷酸酯(β-谷甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷- 6′-O-二十烷酸酯,Ⅵ)、尿嘧啶(Ⅶ)和蔗糖(Ⅷ)。环阿屯醇和异半夏苷在10μmol/L对LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α的抑制率分别为54.7%和47.5%。结论异半夏苷为新化合物,半夏抗炎作用可能与环阿屯醇和异半夏苷有关。

可见-紫外分光光度法测定半夏硫熏前后总生物碱的含量

[目的]考察硫熏对半夏总生物碱含量的影响。[方法]采用可见-紫外分光光度法测定硫熏和非硫熏半夏中总生物碱含量。[结果]比较得出,硫熏后半夏的总生物碱含量明显降低。[结论]半夏产地加工应抛弃硫熏法,探索无硫加工工艺。

几种营养因子对半夏悬浮细胞生长及总生物碱形成的影响

研究了五种营养因子对半夏悬浮细胞生长及总生物碱形成的影响.结果表明,2%～5%的葡萄糖是最为适合的碳源;肌醇对细胞生长的促进效果不大,但100mg/L的肌醇对总生物碱的积累效果显著;钙盐和EDTA-Fe盐对细胞生长和总生物碱形成的影响比较显著,其最适浓度分别为1.8～3.0mmol/L和0.06mmol/L.