利用组培技术构建半夏杂交体系

本研究通过构建半夏品系的杂交体系并研究杂交种苗的扩繁周期,以解决半夏自然杂交成功率低、杂交种苗繁育效率低的问题。对消毒过的半夏花粉和雌蕊以TTC法测定其活力,并通过对比实验确定雌蕊的最佳培养基,对3种新的半夏品系持续培养出F_(1)代杂交苗,通过杂交苗继代探究转接周期和成苗周期。结果表明,半夏雌蕊和花粉的最佳消毒时间为6 min;雌蕊的最佳培养基配方是半糖无琼脂MS培养基20.00 g/L+蔗糖15.00 g/L+琼脂5.00 g/L+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.01 mg/L,pH=5.8。以此为基础,培育出F_(1)代苗;4种半夏品系的F_(1)代杂交苗与亲本组培苗叶型有明显区别,经过扩繁发现了两个杂交种苗的扩繁周期。本研究建立了基于植物组织培养技术的半夏杂交体系并获得杂交苗,并探明杂交种苗的繁育周期。

半夏开花物候与结实特征分析

为深入理解半夏独特的开花物候特征和生殖特性,对半夏花的形态学特征、个体开花散粉习性、居群开花物候及结实特征进行了统计分析。结果表明,半夏群体开花规律呈单峰型,花期集中在5月下旬到6月下旬,花期长约58 d;半夏开花与散粉的日变化规律均呈倒单峰型,开花高峰期为7:00—11:00,而花药散粉高峰期为7:00—9:00;散粉持续时间为47.22 h,个体花期持续时间、花序开放进程、花序开花持续时间和种群花期历时分别为18、13、5.3、51.5 d;花序开放进程与花序开花持续时间分别以14 d和6 d出现的频率最高。半夏花不具虫媒、风媒花特征,传粉完全依靠花粉的自然散落,这可能是其结实率低的主要原因;进一步相关性分析发现,始花时间分别与开花率和结实率存在显著负相关关系,花期长度和开花率分别与结实率呈极显著正相关;开花率、结实率与半夏个体的块茎大小密切相关。综上,人工辅助延长半夏的花期和提高开花率有助于提高其结实率,进而提高有性繁殖效率。

三叶半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit)的间歇浸没培养

目的:利用间歇浸没培养反应器对药用植物三叶半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit)进行组培快繁研究。方法:以增殖倍数、鲜重、平均鲜重、折干率和组培苗状态为指标,一方面对三叶半夏叶片、叶柄及丛生芽体进行培养,考察适合间歇浸没培养的外植体类型;另一方面以叶柄为外植体对三叶半夏进行间歇浸没培养、固体培养和液体摇瓶培养,考察三种培养方式对其生长的影响。结果:不同的外植体在反应器内培养时,从增殖情况来看,丛生芽作为外植体得到的增殖倍数高达39.15,叶柄为27.65,叶片为18.05。鲜重方面与增殖倍数具有相同的规律。从平均鲜重和折干率来看,无显著差异。由组培苗形态来看,以叶柄诱导的组培苗最为健壮,而以丛生芽诱导的组培苗则较为细弱。不同培养方式下的增殖倍数分别为:间歇浸没培养方式最高为24.73,其次固体培养为14.75,液体摇瓶培养为12.26,差异显著。平均鲜重和折干率均为间歇浸没培养最优。由组培苗形态来看固体培养优于间歇浸没培养,反应器得到的组培苗较为细弱。在保卫细胞长宽和叶绿体个数上两者没有显著性差异。而液体摇瓶培养玻璃化导致叶绿体个数减少,不适合培养三叶半夏的。结论:较适合间歇浸没培养的外植体类型为叶柄和丛生芽,以叶柄为优。间歇浸没培养方式相对于传统的固体和液体培养在各项生理指标上表现较好,具有大规模培养三叶半夏的潜力。

半夏枯斑病病原鉴定

目的:明确半夏枯斑病的病原菌种类及其分类学地位。方法:采用组织分离法进行病原菌的分离鉴定,采用柯赫氏法则验证病原菌的致病性,采用形态学鉴定结合多基因系统发育分析,明确病原菌分类学地位。结果:采用组织分离法,从半夏发病植株中分离得到5株菌株,依据柯赫氏法则验证菌株BXHM-1和BXHM-2能够引起半夏叶片发病。基于ITS序列、Tub-2和TEF基因序列进行多基因序列系统发育分析,菌株BXHM-1和BXHM-2与已报道的马铃薯坏疽病菌Boeremia exigua聚集在同一进化分支上。综合形态学和分子生物学鉴定结果,将贵州省赫章县新发现的半夏枯斑病病原鉴定为Boeremia exigua。结论:首次报道Boeremia exigua引起半夏叶部病害,本研究为该病害的防治奠定了基础。

息半夏种质资源遗传多样性的ISSR分析

对信阳息县道地药材息半夏种质资源遗传多样性进行研究,利用ISSR技术对24份半夏进行扩增。共挑选出了8条扩增条带清晰的引物,并检测到117条明显的条带,多态性条带为110条,平均多态性信息指数(PIC)为0.8508,平均观测等位基因数(Na)为1.9279,平均有效等位基因数(Ne)为1.4811,平均Nei氏基因多样性(H)为0.2927,平均香农信息指数(I)为0.4481。利用UPGMA方法进行聚类分析,24份半夏在遗传相似系数0.5901处被分为3个类群。结果表明,24份半夏种质资源具有较高的遗传多样性。

胡萝卜果胶杆菌侵染下半夏转录组中SSR位点信息分析

为开发用于鉴定半夏抗软腐病品种的SSR标记,利用MISA和Excel软件统计分析胡萝卜果胶杆菌侵染下半夏转录组中SSR位点的基元类型、基元组成、出现频率、平均距离等信息。结果表明,在27 252条Unigene中找到符合条件的SSR位点40 621个,出现频率为36.09%,平均遗传距离为2.24 kb。这些SSR标记中二碱基重复是主要重复类型,占总SSR的41.69%,GA/CT、CCG/CGG、AGCT/AGCT、AAAAG/CTTTT分别是二碱基、三碱基、四碱基、五碱基的优势重复单元。序列长度大于20 bp的SSR位点数占23.93%,其中长度大于30 bp的SSR位点数占据比例最多为10.53%。本研究发现,SSR位点的频率高、重复基元的种类多、分布密度大,证明其多态性好。可为后续半夏抗病品种的鉴定、分子育种、进化等研究提供依据。

半夏脱毒与快繁技术研究进展

半夏是我国传统中药材,长期无性繁殖导致病毒积累对半夏产量和品质造成了严重影响。由于半夏茎尖病毒积累少,利用半夏茎尖脱毒快繁技术可有效解决病毒害严重的问题。本研究从半夏主要病毒种类、脱毒方法、组培快繁和病毒检测等方面对半夏脱毒与快繁技术进行综述,以期为半夏脱毒快繁体系的建立提供参考。

半夏叶斑病病原菌的鉴定、生物学特性及其有效杀菌剂研究

目的:对半夏主产区叶斑病进行调查,明确各地叶斑病主要病原菌种类,同时结合生物学特性测定和室内杀菌剂筛选,为半夏叶斑病的防治提供参考。方法:在2020年6~9月,对贵州、河北、甘肃半夏种植区叶斑病进行调查,对致病菌进行分离、回接验证、形态和分子鉴定、生物学特性检测,同时采用平板抑菌实验进行杀菌剂的筛选。结果:引起3种叶斑病的致病菌分别为高粱附球菌Epicoccum sorghinum、南瓜孢子菌Stagonosporopsis cucurbitacearum、茄链格孢Alternaria solani。3种病原菌在温度为25~28℃、pH为弱碱性时适应性较好;菌株E.sorghinum生长不受光照条件的影响,菌株S.cucurbitacearum有光照时生长速率较快,菌株A.solani在24 h暗培养条件下生长迅速。室内药剂筛选结果表明,枯草芽孢杆菌对3种叶斑病菌均有较好的抑制效果,其次为苯醚甲环唑,植物源乙蒜素抑菌效果较差。结论:半夏叶斑病可由多种病原菌引起,室内条件下枯草芽孢杆菌、苯醚甲环唑对本研究筛选到的3株优势致病菌有较好的防治效果,可为半夏叶斑病的田间防控提供一定的依据。

基于ISSR不同繁殖方式半夏的遗传多样性研究

以半夏人工种子苗、组培苗和实生苗为试材,采用ISSR分子标记方法,研究了不同繁殖方式半夏的遗传多样性,以期为促进半夏规模化生产提供参考依据。结果表明:从18条引物中筛选出8条多态性较好的ISSR引物,共扩增出条带109条,多态性百分比75%。Nei's基因多样性范围为0.0976~0.7480,大小按顺序排列为人工种子>大田>组培;Shannon多样性指数范围为0.1081~0.3482,大小按顺序排列为大田>组培>人工种子;3种繁殖方式之间存在有38.03%的遗传分化;对不同繁殖方式半夏之间的遗传距离分析发现,组培半夏和大田半夏的亲缘关系比人工种子和大田半夏的更接近;聚类分析显示,人工种子半夏和组培半夏聚为一类;大田居群不同叶型遗传多样性分析,芍药叶型和桃叶型半夏亲缘关系最为接近,五叶半夏遗传分化最强。因此,人工种子半夏的基因多样性比组培及大田半夏的基因多样性丰富,半夏人工种子比组培苗更适合用于大田实际生产。

内生菌协同发酵对半夏多糖及其生物活性的影响

利用内生菌协同发酵提高半夏[Pinellia ternata(Thunb.)Breit.]多糖含量,并探究对其生物活性的影响。以半夏粉末为底物,采用筛选得到的高产胞外多糖半夏内生菌进行固态协同发酵;以多糖得率为指标,筛选出菌种的最适添加比例;通过单因素试验与正交试验对发酵条件进行优化;并对发酵前、后半夏多糖的电镜结构、抗氧化和降血糖能力进行测定。结果表明,菌种的最适添加比例为土曲霉∶亚黑管菌=2∶1;最佳发酵条件为发酵温度31℃、发酵时间110 h、接种量12%,最终半夏多糖的得率为21.76%,相较于未发酵得到显著提高(P<0.05);发酵后的半夏多糖对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基的IC50分别为0.355、0.600、0.585 mg/mL,相比发酵前半夏多糖的IC50分别减少了0.137、0.231、0.218 mg/mL;其中,它对3种自由基的清除能力从大到小依次为DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基;发酵后半夏多糖抑制α-葡萄糖苷酶的IC50比发酵前减小了0.293 mg/mL。由此可知,内生菌协同发酵能够提高半夏多糖的提取率以及抗氧化与降血糖能力。

遮荫对半夏叶片光合色素与保护酶活性的影响

对半夏进行不同程度遮荫处理,研究了其生长过程中叶组织的光合色素含量、叶绿素a/b值、保护酶体系(SOD、POD、CAT)活性和丙二醛(MDA)含量的变化及其生理特性.结果表明:不同处理的半夏在生长过程中,光合色素的含量呈先升后降的趋势;与全光照相比,遮荫处理的叶绿素含量较高,叶绿素a/b值较低,类胡萝卜素含量在生长发育中早期较低而后期较高;SOD、POD、CAT活性呈由低到高再降低的趋势,MDA含量持续升高;遮荫处理的SOD、POD活性和MDA含量均低于全光照处理,CAT活性则表现为先高于后低于全光照处理.适度的遮荫可以提高半夏叶绿素的含量,降低膜系统受到的伤害,改善半夏的倒苗状况,为半夏叶片的生长提供较好的环境.

半夏转录组中的SSR位点信息分析

目的：分析半夏转录组中的SSR位点信息,并设计SSR引物,为开发新的分子标记奠定基础。方法：利用EST-trimmer和cross-match对转录组测序获得的unigene进行过滤,除去冗杂序列;利用MISA对无冗余unigene进行SSR搜索。结果：从搜索序列中发现14 468个SSR,分布于12 000条unigene中,出现频率为16.24%,分布密度为1/4.33 kb。二核苷酸和三核苷酸是主要重复类型,分别占SSR总数的51.15%和41.50%。AG/CT和CCG/CGG分别是二核苷酸和三核苷酸的优势重复基元,分别占41.54%和11.84%。87.14%的基序长度集中在12-20bp。结论：半夏转录组SSR位点出现频率高、类型丰富、密度大、多态性潜能较高,在半夏遗传多样性研究、分子标记辅助育种、遗传图谱绘制等方面具有很大的应用潜力。

遮荫对半夏生物学特性的影响

对山西产半夏进行了盆栽试验,研究其在全光照和遮荫处理下的生物学特性。结果表明,半夏是喜阴植物,遮荫55%和80%与全光照相比,叶长、叶宽、株高分别增加了38%和27%,8%和25%,59%和101%;叶片的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量分别增加了17%和26%,28%和36%,10%和13%,叶绿素a/b减小;半夏的珠芽数量与鲜重分别增加了215%和101%,177%和56%。综合分析认为,遮荫55%可为半夏生长发育提供较适宜的环境条件,对珠芽数量和质量及半夏总产量的提高有重要意义。

RP-HPLC法同时测定半夏中5种核苷含量的研究

目的:采用反相高效液相色谱法检测半夏药材中的核苷类成分,同时对检测确定的5种核苷进行含量测定。方法:核苷检测采用3种色谱条件,通过与对照品的对照,确定在半夏中5种核苷分别为尿嘧啶、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷。含量测定采用 Ace C_(18)柱(150mm×4.6mm,5μm),以水为流动相,流速:0.8mL·min^(-1),测定波长254nm。结果:尿嘧啶、黄嘌呤为首次在半夏中检测到。尿嘧啶、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的线性范围依次为0.82～8.16,1.52～15.24,3.30～33.04,0.50～5.02,2.98～29.84μg·mL(-1)。r=0.9995～0.9999;回收率:96.4%～102.3%。结论:以 RP-HPLC 法同时测定半夏药材中的5种核苷快速、简便,结果可靠,为测定半夏中核苷类成分提供了有效的方法。

半夏种内不同居群酯酶和超氧化物歧化酶同工酶酶谱特征分析

对栽培在同一生境下的 16个半夏〔Pinelliaternata (Thunb .)Breit.〕居群同一生长期叶片中酯酶 (EST)和超氧化物歧化酶 (SOD)同工酶酶谱进行了比较分析 ,结果表明 :EST和SOD同工酶酶谱在各居群间 ,甚至在同一居群内除少数共有的特征谱带外存在着较为明显的频率差异。EST同工酶在半夏各居群中最多可显示 12条谱带 ,其中在慢区的第 5 (弱带 )和快区的第 10 (强带 ) 2条谱带为各居群所共有的特征谱带 ;SOD同工酶在半夏各居群中最多显示 9条谱带 ,其中在慢区的第 2 (弱带 )、快区的第 5 (强带 )和第 9(强带 )

半夏化学成分的分离与鉴定

目的研究半夏乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部分,对其中的化学成分进行分离鉴定。方法采用硅胶、Sephadex LH-20柱色谱以及制备型高效液相色谱等手段进行分离纯化,通过理化性质和各种波谱技术对化合物进行结构鉴定。结果从半夏的乙酸乙酯萃取部分分离得到10个化合物,分别鉴定为环-(苯丙氨酸-酪氨酸)[cyclo-(Phe-Tyr),1]、环-(亮氨酸-酪氨酸)[cyclo-(Leu-Tyr),2]、尿嘧啶脱氧核苷(2′-deoxyuridine,3)、(+)异落叶松脂醇9-O-β-D-葡萄糖苷[(+)isolaricires-inol9-O-β-D-glucopyranoside,4]、(+)异落叶松脂醇[(+)isolariciresinol,5]、尿嘧啶(uracil,6)、没食子酸(gallic acid,7)、尿苷(uridine,8)、腺苷(adenosine,9)、环-(缬氨酸-酪氨酸)[cyclo-(Val-Tyr),10]。结论化合物1、3、4为首次从半夏属植物中分离得到,化合物2、7、10为首次从半夏中分离得到。

半夏珠芽萌发动态及其影响因子的研究

目的研究半夏P inellia terna ta珠芽的萌发动态及其影响因子,为阐明半夏珠芽的生产应用和珠芽发育生物学提供依据。方法利用完全随机实验设计研究半夏珠芽的萌发动态以及珠芽大小、不同覆土深度、土壤干湿度和不同来源对半夏珠芽萌发和半夏生长的影响。结果四川南充半夏珠芽播种约14 d开始萌发,23 d萌发率达60%以上,29 d完成萌发。直径≥8 mm的珠芽的萌发率显著高于5 mm≤直径<8 mm的珠芽;两种覆土深度10和20 mm对半夏珠芽的萌发和半夏幼苗的生长没有显著性影响;保持土壤湿润的珠芽萌发率显著高于土壤见干见湿的珠芽;从播种到23 d时,四川南充半夏的珠芽萌发率极显著高于山西新绛半夏的珠芽,随后二者的萌发率没有显著性差异。另外发现不同来源的半夏珠芽在萌发时叶形会发生变化。结论培育大的珠芽对半夏繁育有重要意义,保持土壤湿度对提高萌发率和促进半夏幼苗生长有重要作用,不同来源的半夏珠芽具有不同的萌发特点和生长特性,应重视半夏不同品系的筛选。

紫外分光光度法测定不同产地半夏中总生物碱的含量

目的 :测定不同产地半夏中总生物碱的含量 ,比较相互差异。方法 :对半夏药材采用超声提取 ,依据酸性染料比色法的原理 ,在 4 16nm波长下进行比色测定药材中总生物碱。结果 :获得良好的线性关系 (r =0 .9998)和回收率 (10 2 .0 2 % ) ,RSD为 2 .38%。样品在 5 h内基本稳定 (RSD为 0 .32 35 % )。结论 :测定方法简单快速 ;不同产地半夏总生物碱含量有一定差异 。

半夏及其毒针晶刺激性毒性的稳定性研究

目的:考察半夏毒针晶刺激性毒性的稳定性及针晶蛋白对针晶刺激性毒性的贡献,为进一步揭示半夏毒针晶产生刺激性毒性的机制提供依据。方法:不同溶剂及混合蛋白酶液浸泡处理半夏及其毒针晶,用家兔眼结膜刺激性模型考察半夏及其所含针晶的刺激性变化,用电镜扫描法观察毒针晶晶体结构变化,采用垂直凝胶电泳(SDS-PAGE)试验分析蛋白酶液浸泡前后针晶蛋白的条带变化。结果:半夏毒针晶在甲醇、乙醇浸泡24 h内刺激性逐渐消失,半夏生品在75%乙醇溶液润制2 d后刺激性降低,扫描电镜显示经过甲醇、乙醇处理的毒针晶变得易于断碎,针尖锈蚀。混合蛋白酶液浸泡3 min后的半夏毒针晶刺激性急剧下降,SDS-PAGE图谱显示蛋白酶液浸泡后的针晶蛋白被酶解。结论:半夏针晶蛋白对针晶刺激性有贡献。甲醇、乙醇浸泡可使半夏毒针晶刺激性下降,提示可能是由于极性有机溶剂作用于针晶蛋白,逐渐破坏针晶蛋白的功能。

半夏药材HPLC指纹图谱研究

目的:建立渝产半夏的指纹图谱,为半夏药材的质量控制提供依据。方法:采用HPLC法,cosmosilODS(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱,流动相以甲醇-水(0%～5%)连续梯度洗脱,检测波长254nm,流速1.0ml/min,进样量20μL,柱温25℃。结果:建立了6种叶型性状类型半夏的指纹图谱。半夏药材有11个共有峰,多数峰可以达到较好分离。各栽培半夏间共有峰的相对保留时间的RSD均小于0.1%,相对峰面积RSD均小于1%,符合指纹图谱相关要求。结论:建立的HPLC指纹图谱有较好的精密度、重现性和稳定性,可以作为半夏质量评价主要依据之一。