Application of Metabolomics Approach to Study on Chemical Constituents in Cultivated and Wild Pinellia ternate (Thunb.) Breit. and Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume Based on UPLC-ESI-HRMS^n

[Objectives] The aim was to study chemical components of cultivated and wild Pinellia ternate(Thunb.) Breit and Typhonium flagelliforme(Lodd.) Blume by metabolomics technology based on UPLC-ESI-HRMS^n. [Methods] Chemical components of 27 samples of cultivated and wild P. ternate and T. flagelliforme were detected by using UPLC-ESI-HRMS^ntechnology. Differential markers between P. ternate and T. flagelliforme as well as cultivated and wild P. ternate were screened and identified by principal component analysis(PCA) and orthogonal partial least square-discriminate analysis(OPLS-DA). [Results]12 components of P. ternate(cultivated and wild variety) and T.flagelliforme and three components of cultivated and wild P. ternate were screened and identified by OPLS-DA. N-Acetyl-6-hydroxy-L-tryptophan and N-Phenylacetylglutamic were not detected in P. ternate,and these two components can be used as potential markers of P. ternate and T. flagelliforme. [Conclusions]UPLC-ESI-HRMS^n-based metabolomics technology could be used to quickly identify the chemical constituents of P. ternate and effectively distinguish P. ternate and T. flagelliforme,which has reference significance for the quality control of P. ternate.

无机元素与计量学模型结合的半夏产地溯源研究

为建立不同产地半夏无机元素的分析方法和溯源体系,为半夏药材的质量控制和道地性评价提供技术支持。采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)和电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)对我国6个主产区72份半夏样品中K、Ca、Na、Mg、Al等37种无机元素的含量进行测定,并采用方差分析、主成分分析、因子分析等计量学方法进行统计与评价。通过对比BP-神经网络算法、K-最近邻算法、最小二乘支持向量机等多种模式识别方法,探索适合半夏产地溯源的最佳模型。结果表明:不同产地半夏中无机元素的构成各具特征,各无机元素含量在产地间差异显著(P<0.05),其中La、Pb、As、Na、Bi、Hg、Sn、Cd、Ag 9种元素在不同产区间的差异最为明显;3D-plots图显示不同产地半夏样品分布相对集中,具备产地分类的可行性;KNN分类模型(曼哈顿距离)是半夏产地溯源的最佳方法,测试集的正确率达到100%。无机元素分析技术结合适当的计量学模型可以实现半夏的产地溯源。

利用组培技术构建半夏杂交体系

本研究通过构建半夏品系的杂交体系并研究杂交种苗的扩繁周期,以解决半夏自然杂交成功率低、杂交种苗繁育效率低的问题。对消毒过的半夏花粉和雌蕊以TTC法测定其活力,并通过对比实验确定雌蕊的最佳培养基,对3种新的半夏品系持续培养出F_(1)代杂交苗,通过杂交苗继代探究转接周期和成苗周期。结果表明,半夏雌蕊和花粉的最佳消毒时间为6 min;雌蕊的最佳培养基配方是半糖无琼脂MS培养基20.00 g/L+蔗糖15.00 g/L+琼脂5.00 g/L+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.01 mg/L,pH=5.8。以此为基础,培育出F_(1)代苗;4种半夏品系的F_(1)代杂交苗与亲本组培苗叶型有明显区别,经过扩繁发现了两个杂交种苗的扩繁周期。本研究建立了基于植物组织培养技术的半夏杂交体系并获得杂交苗,并探明杂交种苗的繁育周期。

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS和网络药理学的半夏炮制前后差异性物质基础及功效分析

目的基于超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)和多变量统计分析,筛选并鉴定半夏及其不同炮制品的差异性物质基础,并针对共有及差异性物质基础进行网络药理学分析,挖掘半夏炮制前后物质基础与功效变化的关系。方法采用UPLC-Q-TOF-MS/MS检测半夏及其炮制品共42批样品的主要物质基础并筛选差异性成分,运用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA),以VIP>1.5、P<0.01、FC>2或<0.5为筛选标准,通过数据库配对、文献比对鉴定得到差异性成分。进一步通过TCMIP数据库对差异性物质基础检索靶点,对靶点进行蛋白互作分析,最后通过GO富集和KEGG富集分析其代谢通路。结果生半夏与法半夏有14个差异性成分,与生半夏相比,法半夏含量升高的成分主要有甘草酸、甘草次酸、甘草素等,含量降低的成分主要为酰胺类。生半夏与姜半夏有18个差异性成分,主要为核苷类、黄酮类、氨基酸类。鸟苷、黄嘌呤及酪氨酸等含量降低,磷酸腺苷含量升高。生半夏与清半夏有18个差异性成分,清半夏中多种成分相对含量均降低,如鞘氨醇。得到生半夏67个核心靶点,法半夏45个核心靶点,姜半夏38个核心靶点。结论建立的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法能够较好地分离鉴定半夏中的化学成分,结合多变量统计分析和网络药理学,分析半夏及其炮制品的物质基础及潜在作用机制,可为研究作用靶点提供思路,为半夏及其炮制品的临床合理应用提供数据支持。

半夏开花物候与结实特征分析

为深入理解半夏独特的开花物候特征和生殖特性,对半夏花的形态学特征、个体开花散粉习性、居群开花物候及结实特征进行了统计分析。结果表明,半夏群体开花规律呈单峰型,花期集中在5月下旬到6月下旬,花期长约58 d;半夏开花与散粉的日变化规律均呈倒单峰型,开花高峰期为7:00—11:00,而花药散粉高峰期为7:00—9:00;散粉持续时间为47.22 h,个体花期持续时间、花序开放进程、花序开花持续时间和种群花期历时分别为18、13、5.3、51.5 d;花序开放进程与花序开花持续时间分别以14 d和6 d出现的频率最高。半夏花不具虫媒、风媒花特征,传粉完全依靠花粉的自然散落,这可能是其结实率低的主要原因;进一步相关性分析发现,始花时间分别与开花率和结实率存在显著负相关关系,花期长度和开花率分别与结实率呈极显著正相关;开花率、结实率与半夏个体的块茎大小密切相关。综上,人工辅助延长半夏的花期和提高开花率有助于提高其结实率,进而提高有性繁殖效率。

Study of dual-directional regulatory effect of Banxia （Pinellia ternata） and Huanglian （Coptis chinensis） drug pair on gastrointestinal movement of mice

摘要目的：观察半夏-黄连药对对功能性消化不良小鼠胃肠运动的调节作用.方法：采用三种不同配比的半夏-黄连药液（1：1,3：1,4：1）予昆明种雄性小鼠灌胃.10天后用阿托品腹腔注射法复制胃肠运动抑制模型,新斯的明腹腔注射法复制胃肠运动亢进模型,并且检测其小肠推进率.此外,使用与第一个实验相同的建模方法,对半夏-黄连3：1配比组设立高、中、低三种剂量浓度（4.68g/L,2.34g/L和1.17g/L）.运用酶联免疫吸附试验检测小肠组织内胃肠激素如胃泌素、血管活性肠肽和生长抑素的含量.结果：在新斯的明诱导的胃肠运动亢进模型中,3种不同配比的半夏-黄连药液（1：1,3：1,4：1）均能显著降低小鼠的小肠推进率（P=0.003,P=0.012,P=0.021）;在阿托品诱导的胃肠运动抑制模型组中,仅3：1配比的半夏-黄连药液能显著增加模型小鼠的小肠推进率.在新斯的明诱导的胃肠运动亢进模型中,半夏-黄连药液低剂量组、中剂量组和高剂量组的胃泌素水平均低于模型组（P=0.001,P=0.004,P=0.003）.半夏-黄连药液中剂量组和高剂量组的血管活性肠肽水平均高于模型组（P=0.004,P=0.002）.半夏-黄连药液中剂量组的生长抑素水平高于模型组（P=0.002）;在阿托品诱导的胃肠运动抑制模型中,半夏-黄连药液中剂量组和高剂量组的胃泌素水平均高于模型组（P=0.007,P=0.021）.半夏-黄连药液低剂量组,中剂量组和高剂量组的血管活性肠肽水平均高于模型组（P=0.001,P=0.001,P=0.001）.半夏-黄连药液中剂量组的生长抑素水平低于模型组（P=0.001和P=0.006）.结论：半夏-黄连可以通过影响小肠组织内的胃泌素、血管活性肠肽和生长抑素的水平来双向调节由阿托品及新斯诱导的小鼠功能性消化不良.

半夏中一株高产纤维素酶内生真菌的分离、鉴定及活性分析

以羧甲基纤维素钠为主要碳源,采用刚果红染色法从半夏中筛选出一株高产纤维素酶的内生真菌,通过形态学观察及分子生物学技术对其进行鉴定,并对该菌株发酵产物进行抑菌、抗氧化活性测定。结果表明:高产纤维素酶的内生真菌bxg1被鉴定为曲霉属真菌(Aspergillus chevalier)。该菌株透明圈直径D与菌落直径d比值高达2.5。菌株抑菌实验发现,该菌株对供试病原菌均有抑菌效果,对革兰氏阴性菌具有较好的抑菌活性,其中对铜绿假单胞菌的抑菌圈约为1.2 cm;抗氧化实验发现,该菌株对DPPH自由基的清除能力最强,IC 50值为0.056 g/L。

半夏枯斑病病原鉴定

目的:明确半夏枯斑病的病原菌种类及其分类学地位。方法:采用组织分离法进行病原菌的分离鉴定,采用柯赫氏法则验证病原菌的致病性,采用形态学鉴定结合多基因系统发育分析,明确病原菌分类学地位。结果:采用组织分离法,从半夏发病植株中分离得到5株菌株,依据柯赫氏法则验证菌株BXHM-1和BXHM-2能够引起半夏叶片发病。基于ITS序列、Tub-2和TEF基因序列进行多基因序列系统发育分析,菌株BXHM-1和BXHM-2与已报道的马铃薯坏疽病菌Boeremia exigua聚集在同一进化分支上。综合形态学和分子生物学鉴定结果,将贵州省赫章县新发现的半夏枯斑病病原鉴定为Boeremia exigua。结论:首次报道Boeremia exigua引起半夏叶部病害,本研究为该病害的防治奠定了基础。

息半夏种质资源遗传多样性的ISSR分析

对信阳息县道地药材息半夏种质资源遗传多样性进行研究,利用ISSR技术对24份半夏进行扩增。共挑选出了8条扩增条带清晰的引物,并检测到117条明显的条带,多态性条带为110条,平均多态性信息指数(PIC)为0.8508,平均观测等位基因数(Na)为1.9279,平均有效等位基因数(Ne)为1.4811,平均Nei氏基因多样性(H)为0.2927,平均香农信息指数(I)为0.4481。利用UPGMA方法进行聚类分析,24份半夏在遗传相似系数0.5901处被分为3个类群。结果表明,24份半夏种质资源具有较高的遗传多样性。

半夏总黄酮双水相提取工艺优化及抗氧化活性分析

以半夏为试验原料,采用超声波辅助乙醇-硫酸铵双水相体系提取半夏总黄酮,并对其抗氧化活性进行分析。在单因素试验的基础上,用响应面法对半夏总黄酮的提取工艺优化,并以VC为对照,研究其清除DPPH·和·OH的能力。结果表明总黄酮的最佳提取工艺条件为乙醇体积分数38%,硫酸铵质量浓度0.18g/mL,超声时间31 min,超声温度51℃。在最佳提取条件下,测得半夏总黄酮提取率为8.572%,与预测值接近。半夏总黄酮具有一定的抗氧化活性,当浓度为0.5 mg/mL时,对DPPH·清除率为80.5%,IC_(50)值为0.2753mg/mL;当浓度为0.5 mg/mL时,对·OH清除率为76.3%,IC_(50)值为0.3058 mg/mL。双水相法提取工艺稳定可行,可用于半夏中总黄酮的提取,为半夏资源的开发利用提供理论基础。

半夏化学成分及药理作用研究进展

为促进半夏的研究利用及药用价值开发,从半夏的化学成分、药理作用等方面进行综述,提出针对目前发展困境的应对措施,为半夏的研究提供参考依据。

半夏立枯病菌拮抗内生细菌的分离鉴定及功能分析

【目的】从药用植物半夏分离对半夏立枯病病原菌具有拮抗活性的内生细菌并初步探究其抑菌机制,为半夏立枯病的生物防治提供理论和实践依据。【方法】对湖北省潜江市南章莆半夏大棚种植基地的半夏主要病害进行调查和分离,通过柯赫氏法则进行致病性验证,筛选出致病性最强的菌株并进行种类鉴定。采用组织分离法对健康无病半夏进行内生细菌分离及鉴定,通过平板对峙试验筛选出对半夏立枯病病原菌拮抗活性最强的菌株并检测其抑菌谱,测定拮抗菌株无菌发酵液和挥发性物质的抑菌活性,检测拮抗菌株耐酸碱能力、胞外酶活性以及生物被膜的形成能力;通过平板试验检测温度和蛋白酶K对拮抗菌株无菌发酵液抑菌活性的影响;通过乙酸乙酯萃取法提取拮抗菌株的脂肽类活性物质并通过液相色谱—质谱联用仪(LC-MS)检测活性物质的主要成分。【结果】南章莆大棚半夏的主要病害是茎腐病、根腐病、叶斑病和病毒病,发病率分别为20.87%、7.03%、3.57%和4.08%,发病率最高的茎腐病主要是立枯丝核菌引起的半夏立枯病。从半夏种球组织中分离到5株细菌对半夏立枯病病原菌具有拮抗活性,其中菌株B2-7的抑菌效果最好,抑制率为79.60%,经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。抑菌谱测定结果显示,菌株B2-7对12种植物病原真菌均具有拮抗活性,其抑菌率为61.11%~89.47%。菌株B2-7的挥发性物质和无菌发酵液对立枯丝核菌均具有拮抗作用,挥发性物质的抑菌率为41.18%,当无菌发酵液浓度为2.5%、5.0%、10.0%和20.0%时,其抑制率分别为39.40%、56.06%、73.89%和77.09%。菌株B2-7具有一定的耐酸性,但耐碱性较弱。菌株B2-7能产纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和分泌嗜铁素,形成生物被膜的能力较强,且随着菌液浓度的增加呈先增强后下降的变化趋势。菌株B2-7无菌发酵液对温度和蛋白酶K敏感,75℃高温处理拮抗活性下降至23.45%,蛋白酶K处理拮抗活性下降48.60%。菌株B2-7的脂肽类活性物质能抑制立枯丝核菌生长,抑菌带宽2.06mm;LC-MS分析结果显示该菌株脂肽类活性物质中至少含有16种已知的有机化合物,其中包含surfactin、bacillaene、macrolactin和difficidin等多种已报道的拮抗物质。【结论】半夏内生细菌菌株B2-7对半夏立枯病病原菌具有较好的抑制作用,是防治半夏立枯病的潜力菌株,具有良好的应用前景。

半夏miR167及其靶基因响应大豆花叶病毒胁迫的表达

MicroRNAs(miRNAs)是一类小的非编码RNA,在植物逆境及生物胁迫中通过调节靶基因来发挥重要的调控作用。半夏内源miR167是否参与了大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)的胁迫及相互作用关系尚不清楚。本研究利用茎环法扩增半夏内源miR167基因,命名为pt-miR167,采用生物信息学软件对其进行保守性分析,系统进化性分析及靶基因预测。在此基础上,采用qRT-PCR技术检测病毒积累量、miR167及其潜在的靶基因的表达水平,分析miR167及靶基因响应病毒侵染的表达模式。结果表明,病毒积累量在5~15 d时迅速增加,其中10 d时增加最快,随后呈现缓慢上升趋势。病毒侵染后,pt-miR167相比对照组,表达量呈下调,并且在10 d时表达量最低。进化树分析表明,pt-miR167与番茄(Solanum lycopersicum)中的sly-miR167a聚为一族,高度同源。预测的潜在主要靶基因ARF6表达量与pt-miR167表达量呈现正好相反的趋势,其在10 d时表达量达到最高。本研究表明,miRNA167参与了寄主半夏与病毒SMV的相互作用关系,研究结果有助于揭示SMV与寄主半夏之间的相互作用机制,为今后深入研究病毒与植物提供了参考,为半夏生产提供了研究的基础。

半夏脱毒与快繁技术研究进展

半夏是我国传统中药材,长期无性繁殖导致病毒积累对半夏产量和品质造成了严重影响。由于半夏茎尖病毒积累少,利用半夏茎尖脱毒快繁技术可有效解决病毒害严重的问题。本研究从半夏主要病毒种类、脱毒方法、组培快繁和病毒检测等方面对半夏脱毒与快繁技术进行综述,以期为半夏脱毒快繁体系的建立提供参考。

施加种植专用肥对甘肃西和半夏连作障碍的影响研究

[目的]研究种植专用肥对半夏连作土壤肥力、微生物多样性,半夏产量及品质的影响,为缓解半夏连作障碍提供科学施肥依据。[方法]通过大田试验,以传统复合肥料为对照(CK),设定了3个种植专用肥施肥量水平,探究处理组1(2.25 t/hm^(2))、处理组2(3.00 t/hm^(2))和处理组3(3.75 t/hm^(2))对土壤肥力、pH及微生物生态、半夏的农艺性状指标、产量及品质的影响。[结果]对照组半夏的株高和茎粗低于处理组、倒苗率高于处理组;种植专用肥提高了半夏的产量及水溶性浸出物,其中处理组2最为显著;种植专用肥能够改善半夏连作土壤微生物多样性,提高土壤肥力,从而提高半夏产量。[结论]中药材种植专用肥可作为一种防治措施,缓解半夏连作障碍。

半夏叶斑病病原菌的鉴定、生物学特性及其有效杀菌剂研究

目的:对半夏主产区叶斑病进行调查,明确各地叶斑病主要病原菌种类,同时结合生物学特性测定和室内杀菌剂筛选,为半夏叶斑病的防治提供参考。方法:在2020年6~9月,对贵州、河北、甘肃半夏种植区叶斑病进行调查,对致病菌进行分离、回接验证、形态和分子鉴定、生物学特性检测,同时采用平板抑菌实验进行杀菌剂的筛选。结果:引起3种叶斑病的致病菌分别为高粱附球菌Epicoccum sorghinum、南瓜孢子菌Stagonosporopsis cucurbitacearum、茄链格孢Alternaria solani。3种病原菌在温度为25~28℃、pH为弱碱性时适应性较好;菌株E.sorghinum生长不受光照条件的影响,菌株S.cucurbitacearum有光照时生长速率较快,菌株A.solani在24 h暗培养条件下生长迅速。室内药剂筛选结果表明,枯草芽孢杆菌对3种叶斑病菌均有较好的抑制效果,其次为苯醚甲环唑,植物源乙蒜素抑菌效果较差。结论:半夏叶斑病可由多种病原菌引起,室内条件下枯草芽孢杆菌、苯醚甲环唑对本研究筛选到的3株优势致病菌有较好的防治效果,可为半夏叶斑病的田间防控提供一定的依据。

多重连接探针扩增技术鉴别半夏及其常见混伪品

目的基于多重连接探针扩增技术(MLPA)建立一种中药材半夏与其常见伪品虎掌、滴水珠的分子鉴定方法,为半夏药材质量控制提供依据。方法从Genbank数据库下载半夏属核基因组内转录间隔区(ITS)序列,利用MEGA 6.05版软件进行序列比对,依据半夏、虎掌及滴水珠ITS序列中的单核苷酸多态性(SNP)位点设计物种特异性MLPA探针,MLPA反应后采用熔解曲线法对扩增产物进行分析。结果半夏、虎掌和滴水珠样品DNA与物种特异性MLPA探针可分别产生位于84.84,82.76及80.14℃的单一熔解峰,表明探针具有良好特异性;构建的探针体系可对0.1 ng模板DNA进行检测,并可有效检出半夏中掺混1%的虎掌或滴水珠样品。对市场收集样品进行检测,鉴别结果准确,灵敏度高。结论该研究建立的多重连接探针扩增方法可准确鉴别半夏和虎掌、滴水珠,具有特异性强、灵敏度高等特点,可为半夏药材质量控制提供技术支持。

胡萝卜果胶杆菌侵染下半夏转录组中SSR位点信息分析

为开发用于鉴定半夏抗软腐病品种的SSR标记,利用MISA和Excel软件统计分析胡萝卜果胶杆菌侵染下半夏转录组中SSR位点的基元类型、基元组成、出现频率、平均距离等信息。结果表明,在27 252条Unigene中找到符合条件的SSR位点40 621个,出现频率为36.09%,平均遗传距离为2.24 kb。这些SSR标记中二碱基重复是主要重复类型,占总SSR的41.69%,GA/CT、CCG/CGG、AGCT/AGCT、AAAAG/CTTTT分别是二碱基、三碱基、四碱基、五碱基的优势重复单元。序列长度大于20 bp的SSR位点数占23.93%,其中长度大于30 bp的SSR位点数占据比例最多为10.53%。本研究发现,SSR位点的频率高、重复基元的种类多、分布密度大,证明其多态性好。可为后续半夏抗病品种的鉴定、分子育种、进化等研究提供依据。

中药渣不同配比基质对半夏组培苗生长及产量的影响

【目的】探明适宜半夏设施栽培的中药渣基质的最佳配比,为其在半夏种源扩繁及设施栽培上应用提供理论依据。【方法】以中药渣为有机基质成分,研究蛭石、椰糠等无机质与中药渣不同配比基质(T_(1),100%中药渣;T_(2),75%中药渣+15%椰糠+10%蛭石;T_(3),50%中药渣+30%椰糠+20%蛭石;T_(4),25%中药渣+45%椰糠+30%蛭石;T_(5),100%椰糠)对设施栽培半夏组培苗生长发育及产量的影响。【结果】不同处理半夏最终出苗率达99.60%~100.00%,其中T_(3)、T_(4)和T_(5)的出苗率均达100.00%;各处理半夏6月22日倒苗数为88~238株,倒苗率为35.20%~95.20%,T_(5)和T_(4)在90%以上,T_(3)最低,仅35%左右;不同处理半夏珠芽数为662~812个,产量为149.68~199.00 g/667m^(2),均以T_(3)最优。【结论】半夏设施栽培的中药渣基质最佳配比为50%中药渣+30%椰糠+20%蛭石。

半夏组织培养一步成苗技术初步研究

为简化半夏组织培养种苗生产流程,缩短培育周期,建立半夏一步成苗技术,以半夏为试验材料,采用二因素三水平完全随机设计筛选最适外植体及NAA、6-BA浓度配比,并探讨炼苗时间、移栽基质、移栽基质含水量对幼苗移栽成活率及长势的影响。结果表明,以叶片作为外植体,用MS基本培养基+1.5 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA+0.1%活性炭作为培养基有利于半夏一步成苗;组培苗移栽炼苗的最适条件是:闭瓶炼苗2 d、开瓶炼苗3 d,以腐殖土+蛭石为移栽炼苗基质(含水量80%)。