Application of Metabolomics Approach to Study on Chemical Constituents in Cultivated and Wild Pinellia ternate (Thunb.) Breit. and Typhonium flagelliforme (Lodd.) Blume Based on UPLC-ESI-HRMS^n

[Objectives] The aim was to study chemical components of cultivated and wild Pinellia ternate(Thunb.) Breit and Typhonium flagelliforme(Lodd.) Blume by metabolomics technology based on UPLC-ESI-HRMS^n. [Methods] Chemical components of 27 samples of cultivated and wild P. ternate and T. flagelliforme were detected by using UPLC-ESI-HRMS^ntechnology. Differential markers between P. ternate and T. flagelliforme as well as cultivated and wild P. ternate were screened and identified by principal component analysis(PCA) and orthogonal partial least square-discriminate analysis(OPLS-DA). [Results]12 components of P. ternate(cultivated and wild variety) and T.flagelliforme and three components of cultivated and wild P. ternate were screened and identified by OPLS-DA. N-Acetyl-6-hydroxy-L-tryptophan and N-Phenylacetylglutamic were not detected in P. ternate,and these two components can be used as potential markers of P. ternate and T. flagelliforme. [Conclusions]UPLC-ESI-HRMS^n-based metabolomics technology could be used to quickly identify the chemical constituents of P. ternate and effectively distinguish P. ternate and T. flagelliforme,which has reference significance for the quality control of P. ternate.

利用组培技术构建半夏杂交体系

本研究通过构建半夏品系的杂交体系并研究杂交种苗的扩繁周期,以解决半夏自然杂交成功率低、杂交种苗繁育效率低的问题。对消毒过的半夏花粉和雌蕊以TTC法测定其活力,并通过对比实验确定雌蕊的最佳培养基,对3种新的半夏品系持续培养出F_(1)代杂交苗,通过杂交苗继代探究转接周期和成苗周期。结果表明,半夏雌蕊和花粉的最佳消毒时间为6 min;雌蕊的最佳培养基配方是半糖无琼脂MS培养基20.00 g/L+蔗糖15.00 g/L+琼脂5.00 g/L+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.01 mg/L,pH=5.8。以此为基础,培育出F_(1)代苗;4种半夏品系的F_(1)代杂交苗与亲本组培苗叶型有明显区别,经过扩繁发现了两个杂交种苗的扩繁周期。本研究建立了基于植物组织培养技术的半夏杂交体系并获得杂交苗,并探明杂交种苗的繁育周期。

三叶半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit)的间歇浸没培养

目的:利用间歇浸没培养反应器对药用植物三叶半夏(Pinellia ternata(Thunb.)Breit)进行组培快繁研究。方法:以增殖倍数、鲜重、平均鲜重、折干率和组培苗状态为指标,一方面对三叶半夏叶片、叶柄及丛生芽体进行培养,考察适合间歇浸没培养的外植体类型;另一方面以叶柄为外植体对三叶半夏进行间歇浸没培养、固体培养和液体摇瓶培养,考察三种培养方式对其生长的影响。结果:不同的外植体在反应器内培养时,从增殖情况来看,丛生芽作为外植体得到的增殖倍数高达39.15,叶柄为27.65,叶片为18.05。鲜重方面与增殖倍数具有相同的规律。从平均鲜重和折干率来看,无显著差异。由组培苗形态来看,以叶柄诱导的组培苗最为健壮,而以丛生芽诱导的组培苗则较为细弱。不同培养方式下的增殖倍数分别为:间歇浸没培养方式最高为24.73,其次固体培养为14.75,液体摇瓶培养为12.26,差异显著。平均鲜重和折干率均为间歇浸没培养最优。由组培苗形态来看固体培养优于间歇浸没培养,反应器得到的组培苗较为细弱。在保卫细胞长宽和叶绿体个数上两者没有显著性差异。而液体摇瓶培养玻璃化导致叶绿体个数减少,不适合培养三叶半夏的。结论:较适合间歇浸没培养的外植体类型为叶柄和丛生芽,以叶柄为优。间歇浸没培养方式相对于传统的固体和液体培养在各项生理指标上表现较好,具有大规模培养三叶半夏的潜力。

半夏开花物候与结实特征分析

为深入理解半夏独特的开花物候特征和生殖特性,对半夏花的形态学特征、个体开花散粉习性、居群开花物候及结实特征进行了统计分析。结果表明,半夏群体开花规律呈单峰型,花期集中在5月下旬到6月下旬,花期长约58 d;半夏开花与散粉的日变化规律均呈倒单峰型,开花高峰期为7:00—11:00,而花药散粉高峰期为7:00—9:00;散粉持续时间为47.22 h,个体花期持续时间、花序开放进程、花序开花持续时间和种群花期历时分别为18、13、5.3、51.5 d;花序开放进程与花序开花持续时间分别以14 d和6 d出现的频率最高。半夏花不具虫媒、风媒花特征,传粉完全依靠花粉的自然散落,这可能是其结实率低的主要原因;进一步相关性分析发现,始花时间分别与开花率和结实率存在显著负相关关系,花期长度和开花率分别与结实率呈极显著正相关;开花率、结实率与半夏个体的块茎大小密切相关。综上,人工辅助延长半夏的花期和提高开花率有助于提高其结实率,进而提高有性繁殖效率。

半夏枯斑病病原鉴定

目的:明确半夏枯斑病的病原菌种类及其分类学地位。方法:采用组织分离法进行病原菌的分离鉴定,采用柯赫氏法则验证病原菌的致病性,采用形态学鉴定结合多基因系统发育分析,明确病原菌分类学地位。结果:采用组织分离法,从半夏发病植株中分离得到5株菌株,依据柯赫氏法则验证菌株BXHM-1和BXHM-2能够引起半夏叶片发病。基于ITS序列、Tub-2和TEF基因序列进行多基因序列系统发育分析,菌株BXHM-1和BXHM-2与已报道的马铃薯坏疽病菌Boeremia exigua聚集在同一进化分支上。综合形态学和分子生物学鉴定结果,将贵州省赫章县新发现的半夏枯斑病病原鉴定为Boeremia exigua。结论:首次报道Boeremia exigua引起半夏叶部病害,本研究为该病害的防治奠定了基础。

息半夏种质资源遗传多样性的ISSR分析

对信阳息县道地药材息半夏种质资源遗传多样性进行研究,利用ISSR技术对24份半夏进行扩增。共挑选出了8条扩增条带清晰的引物,并检测到117条明显的条带,多态性条带为110条,平均多态性信息指数(PIC)为0.8508,平均观测等位基因数(Na)为1.9279,平均有效等位基因数(Ne)为1.4811,平均Nei氏基因多样性(H)为0.2927,平均香农信息指数(I)为0.4481。利用UPGMA方法进行聚类分析,24份半夏在遗传相似系数0.5901处被分为3个类群。结果表明,24份半夏种质资源具有较高的遗传多样性。

半夏miR167及其靶基因响应大豆花叶病毒胁迫的表达

MicroRNAs(miRNAs)是一类小的非编码RNA,在植物逆境及生物胁迫中通过调节靶基因来发挥重要的调控作用。半夏内源miR167是否参与了大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)的胁迫及相互作用关系尚不清楚。本研究利用茎环法扩增半夏内源miR167基因,命名为pt-miR167,采用生物信息学软件对其进行保守性分析,系统进化性分析及靶基因预测。在此基础上,采用qRT-PCR技术检测病毒积累量、miR167及其潜在的靶基因的表达水平,分析miR167及靶基因响应病毒侵染的表达模式。结果表明,病毒积累量在5~15 d时迅速增加,其中10 d时增加最快,随后呈现缓慢上升趋势。病毒侵染后,pt-miR167相比对照组,表达量呈下调,并且在10 d时表达量最低。进化树分析表明,pt-miR167与番茄(Solanum lycopersicum)中的sly-miR167a聚为一族,高度同源。预测的潜在主要靶基因ARF6表达量与pt-miR167表达量呈现正好相反的趋势,其在10 d时表达量达到最高。本研究表明,miRNA167参与了寄主半夏与病毒SMV的相互作用关系,研究结果有助于揭示SMV与寄主半夏之间的相互作用机制,为今后深入研究病毒与植物提供了参考,为半夏生产提供了研究的基础。

半夏脱毒与快繁技术研究进展

半夏是我国传统中药材,长期无性繁殖导致病毒积累对半夏产量和品质造成了严重影响。由于半夏茎尖病毒积累少,利用半夏茎尖脱毒快繁技术可有效解决病毒害严重的问题。本研究从半夏主要病毒种类、脱毒方法、组培快繁和病毒检测等方面对半夏脱毒与快繁技术进行综述,以期为半夏脱毒快繁体系的建立提供参考。

半夏叶斑病病原菌的鉴定、生物学特性及其有效杀菌剂研究

目的:对半夏主产区叶斑病进行调查,明确各地叶斑病主要病原菌种类,同时结合生物学特性测定和室内杀菌剂筛选,为半夏叶斑病的防治提供参考。方法:在2020年6~9月,对贵州、河北、甘肃半夏种植区叶斑病进行调查,对致病菌进行分离、回接验证、形态和分子鉴定、生物学特性检测,同时采用平板抑菌实验进行杀菌剂的筛选。结果:引起3种叶斑病的致病菌分别为高粱附球菌Epicoccum sorghinum、南瓜孢子菌Stagonosporopsis cucurbitacearum、茄链格孢Alternaria solani。3种病原菌在温度为25~28℃、pH为弱碱性时适应性较好;菌株E.sorghinum生长不受光照条件的影响,菌株S.cucurbitacearum有光照时生长速率较快,菌株A.solani在24 h暗培养条件下生长迅速。室内药剂筛选结果表明,枯草芽孢杆菌对3种叶斑病菌均有较好的抑制效果,其次为苯醚甲环唑,植物源乙蒜素抑菌效果较差。结论:半夏叶斑病可由多种病原菌引起,室内条件下枯草芽孢杆菌、苯醚甲环唑对本研究筛选到的3株优势致病菌有较好的防治效果,可为半夏叶斑病的田间防控提供一定的依据。

施加种植专用肥对甘肃西和半夏连作障碍的影响研究

[目的]研究种植专用肥对半夏连作土壤肥力、微生物多样性,半夏产量及品质的影响,为缓解半夏连作障碍提供科学施肥依据。[方法]通过大田试验,以传统复合肥料为对照(CK),设定了3个种植专用肥施肥量水平,探究处理组1(2.25 t/hm^(2))、处理组2(3.00 t/hm^(2))和处理组3(3.75 t/hm^(2))对土壤肥力、pH及微生物生态、半夏的农艺性状指标、产量及品质的影响。[结果]对照组半夏的株高和茎粗低于处理组、倒苗率高于处理组;种植专用肥提高了半夏的产量及水溶性浸出物,其中处理组2最为显著;种植专用肥能够改善半夏连作土壤微生物多样性,提高土壤肥力,从而提高半夏产量。[结论]中药材种植专用肥可作为一种防治措施,缓解半夏连作障碍。

胡萝卜果胶杆菌侵染下半夏转录组中SSR位点信息分析

为开发用于鉴定半夏抗软腐病品种的SSR标记,利用MISA和Excel软件统计分析胡萝卜果胶杆菌侵染下半夏转录组中SSR位点的基元类型、基元组成、出现频率、平均距离等信息。结果表明,在27 252条Unigene中找到符合条件的SSR位点40 621个,出现频率为36.09%,平均遗传距离为2.24 kb。这些SSR标记中二碱基重复是主要重复类型,占总SSR的41.69%,GA/CT、CCG/CGG、AGCT/AGCT、AAAAG/CTTTT分别是二碱基、三碱基、四碱基、五碱基的优势重复单元。序列长度大于20 bp的SSR位点数占23.93%,其中长度大于30 bp的SSR位点数占据比例最多为10.53%。本研究发现,SSR位点的频率高、重复基元的种类多、分布密度大,证明其多态性好。可为后续半夏抗病品种的鉴定、分子育种、进化等研究提供依据。

内生菌协同发酵对半夏多糖及其生物活性的影响

利用内生菌协同发酵提高半夏[Pinellia ternata(Thunb.)Breit.]多糖含量,并探究对其生物活性的影响。以半夏粉末为底物,采用筛选得到的高产胞外多糖半夏内生菌进行固态协同发酵;以多糖得率为指标,筛选出菌种的最适添加比例;通过单因素试验与正交试验对发酵条件进行优化;并对发酵前、后半夏多糖的电镜结构、抗氧化和降血糖能力进行测定。结果表明,菌种的最适添加比例为土曲霉∶亚黑管菌=2∶1;最佳发酵条件为发酵温度31℃、发酵时间110 h、接种量12%,最终半夏多糖的得率为21.76%,相较于未发酵得到显著提高(P<0.05);发酵后的半夏多糖对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基的IC50分别为0.355、0.600、0.585 mg/mL,相比发酵前半夏多糖的IC50分别减少了0.137、0.231、0.218 mg/mL;其中,它对3种自由基的清除能力从大到小依次为DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基;发酵后半夏多糖抑制α-葡萄糖苷酶的IC50比发酵前减小了0.293 mg/mL。由此可知,内生菌协同发酵能够提高半夏多糖的提取率以及抗氧化与降血糖能力。

半夏转录组中的SSR位点信息分析

目的：分析半夏转录组中的SSR位点信息,并设计SSR引物,为开发新的分子标记奠定基础。方法：利用EST-trimmer和cross-match对转录组测序获得的unigene进行过滤,除去冗杂序列;利用MISA对无冗余unigene进行SSR搜索。结果：从搜索序列中发现14 468个SSR,分布于12 000条unigene中,出现频率为16.24%,分布密度为1/4.33 kb。二核苷酸和三核苷酸是主要重复类型,分别占SSR总数的51.15%和41.50%。AG/CT和CCG/CGG分别是二核苷酸和三核苷酸的优势重复基元,分别占41.54%和11.84%。87.14%的基序长度集中在12-20bp。结论：半夏转录组SSR位点出现频率高、类型丰富、密度大、多态性潜能较高,在半夏遗传多样性研究、分子标记辅助育种、遗传图谱绘制等方面具有很大的应用潜力。

遮荫对半夏叶片光合色素与保护酶活性的影响

对半夏进行不同程度遮荫处理,研究了其生长过程中叶组织的光合色素含量、叶绿素a/b值、保护酶体系(SOD、POD、CAT)活性和丙二醛(MDA)含量的变化及其生理特性.结果表明:不同处理的半夏在生长过程中,光合色素的含量呈先升后降的趋势;与全光照相比,遮荫处理的叶绿素含量较高,叶绿素a/b值较低,类胡萝卜素含量在生长发育中早期较低而后期较高;SOD、POD、CAT活性呈由低到高再降低的趋势,MDA含量持续升高;遮荫处理的SOD、POD活性和MDA含量均低于全光照处理,CAT活性则表现为先高于后低于全光照处理.适度的遮荫可以提高半夏叶绿素的含量,降低膜系统受到的伤害,改善半夏的倒苗状况,为半夏叶片的生长提供较好的环境.

半夏生物碱最佳提取条件的研究

本文采用正交试验,研究了从半夏中提取生物碱的工艺。研究结果表明:采用溶剂法提取半夏生物碱时,最佳的提取条件为:材料粉碎至60目,以2.575 mol/L的氨水搅拌均匀材料,加18倍的氯仿,于室温下浸提25h;半夏生物碱最高提取率为0.0817％。

半夏总生物碱含量的动态变化

目的 :测定半夏不同生长期总生物碱的含量 ,为确定合理的采收期提供依据。方法 :采用氯仿提取 ,依据酸性染料比色法的原理 ,在 4 17nm波长下测定 ,并作方差分析。结果 :获得良好的线性关系 (r =0 9989)和回收率 ( 10 0 1% ) ,RSD为 2 3%。半夏不同生长期总生物碱含量差异显著 (F =12 789,P <0 0 1)。结论 :测定方法简单快速 ;半夏不同生长期总生物碱含量以全苗期最高 ,每株平均总生物碱产量以集中倒苗期最高 。

4SB-800型半夏收获机的设计

根据半夏的种植特点和半夏块茎的尺寸及其在土壤中的分布规律,确定了与TN-55(TN-654)等拖拉机配套的4SB-800型半夏收获机的总体结构方案,完成了挖掘、输送和分离等主要工作部件的设计计算、参数确定,为块茎类作物收获提供了一种新的机型。

RP-HPLC法同时测定半夏中5种核苷含量的研究

目的:采用反相高效液相色谱法检测半夏药材中的核苷类成分,同时对检测确定的5种核苷进行含量测定。方法:核苷检测采用3种色谱条件,通过与对照品的对照,确定在半夏中5种核苷分别为尿嘧啶、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷。含量测定采用 Ace C_(18)柱(150mm×4.6mm,5μm),以水为流动相,流速:0.8mL·min^(-1),测定波长254nm。结果:尿嘧啶、黄嘌呤为首次在半夏中检测到。尿嘧啶、黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的线性范围依次为0.82～8.16,1.52～15.24,3.30～33.04,0.50～5.02,2.98～29.84μg·mL(-1)。r=0.9995～0.9999;回收率:96.4%～102.3%。结论:以 RP-HPLC 法同时测定半夏药材中的5种核苷快速、简便,结果可靠,为测定半夏中核苷类成分提供了有效的方法。

遮荫对半夏生物学特性的影响

对山西产半夏进行了盆栽试验,研究其在全光照和遮荫处理下的生物学特性。结果表明,半夏是喜阴植物,遮荫55%和80%与全光照相比,叶长、叶宽、株高分别增加了38%和27%,8%和25%,59%和101%;叶片的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量分别增加了17%和26%,28%和36%,10%和13%,叶绿素a/b减小;半夏的珠芽数量与鲜重分别增加了215%和101%,177%和56%。综合分析认为,遮荫55%可为半夏生长发育提供较适宜的环境条件,对珠芽数量和质量及半夏总产量的提高有重要意义。

真伪半夏二维相关红外光谱法的鉴别研究

本文采用红外光谱法 (FTIR)并结合二维相关光谱分析技术 (Two DimensionalCorrelationSpectroscopy) ,对正品半夏和伪品水半夏进行了无损快速鉴别研究。半夏和水半夏在一维谱图上差别不显著 ,而在二维谱图上具有显著性的差别。在 12 2 0～ 170 0cm- 1 波段范围内 ,半夏在同步图上有 1个较强的自动峰 ,在 14 10cm- 1 附近。而水半夏不仅在 14 10cm- 1 有一个比正品半夏较强的自动峰 ,还在 15 4 0和 16 80cm- 1 附近出现了自动峰 ;同样在 94 0～ 12 2 0cm- 1 波段范围内半夏有 3个较强的自动峰 ,分别在 980 ,10 80和 115 0cm- 1 附近 ,而水半夏只有 2个较强的自动峰 ,在 10 80和 115 0cm- 1 附近。在 980cm- 1 处未出现自动峰。两个波段的异步谱也显示出较大的差别。结果表明 :正品半夏和伪品水半夏的二维相关谱可以用于药材真伪品的鉴别依据。该法快速、准确 ,为中药材的快速鉴别提供了一种新的方法和手段。