平欧杂种榛实时荧光定量PCR内参基因的筛选与体系建立

【目的】构建中国榛属植物主要栽培种平欧杂种榛实时荧光定量PCR内参基因的筛选体系,并筛选稳定的内参基因,为榛属植物的基因表达分析提供内参基因,进而为其植物资源利用和创新育种研究提供理论基础。【方法】利用课题组前期对平欧杂种榛不同亲和性授粉、授粉后不同时间的雌蕊转录组测序数据,结合相关文献搜索,共选取12个候选内参基因;以平欧杂种榛主栽品种‘达维’的盛花期雌蕊、未伸长期雄花序、幼嫩叶片、花粉、一年生枝形成层、嫩茎、根尖、根蘖等8个不同组织器官为研究材料;通过反转录PCR初筛,实时荧光定量PCR检测表达量,并利用ge Norm、Norm Finder、Best Keeper、Delta Ct程序和Ref Finder在线网站评价内参基因的稳定性。【结果】反转录PCR初筛表明,12个候选内参基因引物的特异性良好,Cha STP5和Cha TF在不同组织器官材料中表达存在明显差异,其余候选内参基因在8个组织中均有表达。实时荧光定量PCR的表达谱分析表明,Ch18S r RNA的表达量最高,Cha STP5表达量最低,其余10个候选内参基因均为中等表达量;Cha STP5和Cha TF的稳定性最差,其余10个候选内参基因的稳定性处于中等水平。ge Norm、Norm Finder、Best Keeper和Delta Ct的结果表明,Cha Actin均排名第一,为最稳定的内参基因,Ch18S r RNA的排名均在前五,而其他候选内参基因在不同程序分析结果中的排名存在差异。稳定性综合分析表明,Cha Actin和Ch18S r RNA的稳定性良好,即在8个不同组织器官中表达量均一且在4个稳定性分析程序中均排名靠前,适合作为内参基因;ge Norm程序的变异系数分析则表明,选取6个内参基因便可对RT-q PCR的数据进行精准的标准化处理;相关性分析表明,4个程序均在0.01水平上呈现显著的相关性,Norm Finder和Delta Ct程序的相关性最高,Delta Ct与Best Keeper的相关性最低。【结论】建立了平欧杂种榛实时荧光定量PCR内参基因的筛选体系:以反转录PCR初筛引物,荧光定量PCR分析引物特性及基因表达,4个程序单独评价引物稳定性,Ref Finder综合分析选出最适稳定内参基因,并选出榛属植物8个不同组织器官中最为稳定的2个内参基因Cha Actin和Ch18S r RNA。

基于EST-SSR标记的平欧杂种榛品种鉴定

为建立准确、高效的平欧杂种榛品种鉴定方法,本研究收集目前国内普遍引种的平欧杂种榛品种(品系)43个,选用课题组已开发的12对EST-SSR引物进行品种鉴定方法研究。结果表明:不同引物在供试样品中的PIC值为0.3800~0.7839,平均为0.5113,各引物组合经毛细管电泳均显示出了良好的扩增效果;平欧杂种榛品种(品系)间的亲缘关系较为复杂,其中薄壳红和平欧62、平欧3和平欧7、平欧30和平欧48的遗传距离最近;引物CAF-2、CAF-3、CAF-12和CAF-13组合使用,可完全区分43个平欧杂种榛品种(品系),其中引物CAF-2与CAF-13组合使用,可鉴定16个主栽品种(品系)。上述研究结果为平欧杂种榛的品种鉴定提供了便捷、有效的方法,也可为其他榛属植物研究提供参考。

应用FISH-AFLP技术分析平欧杂种榛主栽品种的遗传关系

【目的】建立平欧杂种榛FISH-AFLP技术体系,并应用该技术分析平欧杂种榛主栽品种的遗传关系。【方法】以达维等10个主栽品种为试材,经DNA提取、PstⅠ/MseⅠ双酶切,进行FISH-AFLP反应,数据转换为"0—1"矩阵后,使用NTSYS pc 2.11F和Popgene 1.32软件进行数据分析并作图。【结果】从64对引物中,筛选出15对多态性强的PstⅠ/MseⅠ引物,共获得1 739条谱带,引物平均多态带比率97.94%;平欧杂种榛主栽品种的相似性系数为0.7556—0.8543,当阈值为0.8398时,可分成4个AFLP群,其中,玉坠(84-310)、辽榛4号(85-41)和平欧69号(84-69)单独为1群,其他品种为1群;平欧杂种榛主栽品种的有效等位基因数、基因多样度、Shannon信息指数分别为1.3921、0.2482和0.3957,具有较高的遗传多样性;研究获得的特征条带可用于平欧杂种榛主栽品种的快速鉴别。【结论】由于平欧杂种榛的实生选优群体是多亲本组合的混合后代,因此,该群体是一个具有高度遗传多样性的群体,主栽品种间存在复杂的亲缘关系;研究构建的FISH-AFLP技术流程、筛选得到的引物以及分析得到的各项遗传参数,可为其他榛属植物的相关研究提供参考。

平欧杂种榛主栽品种(系)遗传关系的ISSR分析

采用ISSR分子标记的方法，对达维、辽榛3号等17个平欧杂种榛主栽品种（系）进行了遗传关系研究。试验从60条ISSR引物中筛选出7条进行电泳分析，使用NTSYSpc 2．11F和Popgene 1．32软件进行数据统计分析并作图。结果显示：7条ISSR引物共获得58条谱带，平均每条引物8．3条谱带，引物平均多态性比率84．6％；7条ISSR引物可将所有样品完全分开，当遗传相似性阈值为0．687时可将样品分成3个类群：第1类群14个品种（系）可分成4个亚类，第Ⅱ类群1个品种，第Ⅲ类群2个品系。样品间的遗传相似性系数为0．448～0．879（平均0．678）。群体的有效等位基因数、基因多样度、Shannon信息指数分别为1．6751、0．3701和0．5308。上述结果表明，平欧杂种榛是一个具有高度遗传多样性的群体，主栽品种（系）间存在复杂的亲缘关系。该研究结果对于平欧杂种榛的遗传关系研究具有重要意义，也可为其他榛属植物的相关研究提供参考。

盐胁迫对3种平欧杂种榛幼苗叶片解剖结构及离子吸收、运输与分配的影响

研究盐胁迫下3个品种平欧杂种榛幼苗叶片解剖结构和离子代谢特征,以揭示盐胁迫响应与适应机制及不同品种的耐盐性差异。以‘达维’、‘辽榛7号’、‘玉坠’2年生压条苗为材料,在盆栽条件下经轻度、中度、重度(分别为50、100、200 mmol/L NaCl)盐胁迫处理,设对照为0,研究幼苗叶片显微解剖结构参数和Na^(+)、K^(+)、Cl^(-)、Ca^(2+)含量的变化及其在根、茎、叶中的吸收、运输和分配特征。不同品种平欧杂种榛叶片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、栅栏组织和海绵组织厚度随着盐胁迫程度的增强呈现出先增加后降低的特点,轻度和中度胁迫下各参数显著高于对照。中度盐胁迫显著提高了各品种叶片结构紧密度。盐胁迫导致平欧杂种榛根、茎、叶Na^(+)和Cl^(-)含量明显高于对照。盐胁迫下,Na^(+)和Cl^(-)在叶中的绝对含量明显高于茎和根,但二者的增幅以根中最大,叶中最小,表明平欧杂种榛根系首先会吸收并截留一定数量的Na^(+)和Cl^(-),然后将其运输至茎和叶中。与对照相比,轻度和中度盐胁迫下根、茎对K^(+)和Ca^(2+)的吸收保持稳定或减少,叶对K^(+)和Ca^(2+)的吸收则有所增加,重度胁迫下根、茎、叶K^(+)含量以及茎、叶中Ca^(2+)含量显著减少。盐胁迫导致不同品种平欧杂种榛根、茎、叶K^(+)/Na^(+)比和Ca^(2+)/Na^(+)比显著降低。随着盐胁迫程度的增强,不同品种平欧杂种榛从根到叶以及从茎到叶的S_(K^(+),Na^(+))和S_(Ca^(2+),Na^(+))均表现为先升高后降低的趋势,盐胁迫对‘辽榛7号’和‘玉坠’从根到茎的S_(K^(+),Na^(+))影响不显著。盐胁迫下,平欧杂种榛叶片通过一系列形态结构的调整来适应盐渍化生境,在积累盐离子的同时,通过加强对K^(+)和Ca^(2+)的选择性吸收和运输能力来维持体内的离子平衡以及较高的K^(+)/Na^(+)和Ca^(2+)/Na^(+)比,进而维持盐胁迫下机体正常的生理代谢活动。盐胁迫下‘辽榛7号’表现出更强的形态与生理适应性,其耐盐性强于‘达维’和‘玉坠’。

盐碱胁迫对平欧杂种榛生长及叶片内源激素含量的影响

利用中性盐Na Cl、碱性盐Na2CO3及混合盐碱(Na Cl∶Na2CO3=1∶1)设置3种盐碱胁迫处理,研究平欧杂种榛"辽榛3号"在不同类型、不同浓度的盐碱胁迫下生长指标及内源激素的变化,分析各内源激素与生长指标的相关关系。结果表明:3种盐碱胁迫对平欧杂种榛株高、新梢长度及叶片数净生长量、地上部生物量、总生物量抑制作用明显,且Na Cl胁迫>混合盐碱胁迫>Na2CO3胁迫,而各处理根冠比显著增加;低浓度盐碱胁迫对地径有明显的增粗效应,在50、100 mmol·L-1Na2CO3胁迫下,地下部生物量显著增加;此外,Na Cl胁迫还显著降低了平欧杂种榛叶片含水量。3种胁迫条件下,平欧杂种榛叶片的ABA含量明显增加,且(GA+IAA+ZR)/ABA比值与对照相比均显著降低,同时发现Na2CO3胁迫下ABA积累更快,且与胁迫浓度无关,而Na Cl胁迫下ABA含量与胁迫浓度显著正相关。相关分析表明:(GA+IAA+ZR)/ABA比值与株高、新梢长度、新梢叶片数存在显著正相关,而与根冠比呈极显著的负相关。由上可知,平欧杂种榛在中性盐下的生长指标受抑制程度大于碱性盐和混合盐碱,不同盐碱胁迫下内源激素响应特征也存在差异,表明平欧杂种榛对Na2CO3的耐受力高于Na Cl。

平欧杂种榛遗传多样性的SSR分析

分析平欧杂种榛间的遗传关系,为遗传图谱的绘制及优良基因的选育奠定基础。该实验选用21份主栽品种,经DNA提取、SSR标记及NTSYSpc（version 2.11 a）对结果的分析建立遗传聚类图。筛选6对欧榛SSR引物对供试材料进行检测,共检测出71个遗传位点,全部为多态性遗传位点,多态位点百分率为100%。遗传相似系数为0.34-0.82,平均相似系数为0.55,当阈值为0.74时,供试样品可聚类分为4个组。C1、C13和C2聚为一组,即组Ⅰ;C6和C15聚为一组,即组Ⅱ;C7、C9、C14、C16和C10聚为一组,即组Ⅳ;其余样品聚为一组,即组Ⅲ。平欧杂种榛品种间具有丰富的遗传多样性,供试主栽品种间存在着复杂的亲缘关系;构建的技术体系可为其他相关试验提供参考。

平欧杂种榛雌花芽分化过程研究

采用石蜡切片法对平欧杂种榛(Corylus heterophylla Fisch.×C.avellana L.)品种平欧124号的雌花芽分化过程进行了观察。结果表明,榛为单性花,其雌花芽的形态分化过程可划分为花芽分化初期、苞叶原基形成期(顶花序原始体出现期)、花蕾原基形成期、果苞原基形成期、雌蕊原基形成期(包括花柱原基形成期和子房显现期)和花柱伸长期6个阶段。在沈阳地区,平欧124号的顶花序原始体主要在7月中旬形成,之后逐渐分化出果苞、花柱和子房;最后随着花柱原基的不断伸长,雌花芽形态分化结束,全部过程历时2～3个月。观测中发现单个花蕾原基上可形成单一花柱或双生花柱。

平欧杂种榛主栽品种需冷量、需热量研究

[目的]揭示平欧杂种榛主栽品种的需冷量和需热量,更好地指导生产做好区域化栽培。[方法]本研究以16个平欧杂种榛主栽品种的1年生枝条为试材,以野生平榛1年生枝条为对照,通过水培观察的方法,首次对平欧杂种榛的雌、雄花序和叶芽进行需冷量和需热量研究。[结果]表明:平欧杂种榛不同器官的需冷量由低到高依次为雄花序336 1 176 h、雌花序504 1 344 h、叶芽672 1 512 h;需热量由低到高依次为雄花序687.0 998.5GDH℃、雌花序998.5 3 496.1 GDH℃、叶芽2 546.5 4 180.3 GDH℃;不同品种、器官在刚满足最低蓄冷要求时需热量最高,随着蓄冷时间的延长,需热量逐渐减少。[结论]首次报道了平欧杂种榛主栽品种雄、雌花序和叶芽的需冷量和需热量数据,其中,达维、平欧48号等品种花器官需冷量较低,辽榛2号、平欧545号等品种花器官需冷量较高;玉坠、平欧69号等品种花器官需热量较低,辽榛1号、辽榛4号等品种花器官需热量较高,上述研究丰富了榛属植物开花和休眠解除方面的数据,可为平欧杂种榛的引种和栽培提供参考。

平欧杂种榛和毛榛层积催芽的试验研究

设3个不同层积天数,对平欧杂种榛和毛榛种子进行层积催芽试验,将层积后的种子播种在3种不同的土壤基质(羊粪+沙壤土、牛粪+沙壤土和沙壤土)上,测定这3种基质对平欧杂种榛和毛榛实生苗生长的影响。结果表明,层积60d以上对打破平欧杂种榛和毛榛种子的休眠有较好的作用,能显著提高其出苗率。层积90d有促进榛苗高生长的作用。不同基质对榛苗高的影响差异显著,其中牛粪+沙壤土这种基质的苗高极显著高于沙壤土的,沙壤土这种基质的苗高极显著高于羊粪+沙壤土的。

化学试剂处理对平欧杂种榛栽植成活和生长影响

研究了11种具有生根效果的化学试剂对10个品种(系)平欧杂种榛压条苗栽植成活和生长的影响。结果表明,试剂处理可显著提高榛苗栽植成活率,促进植株根系发育和地上部枝叶生长。根特佳处理栽植成活效果最高,达86%,生根粉WP、NEB处理效果较好,成活率分别为84%和82%,都极显著地高于清水对照处理(70%);生根粉WP和NEB处理处理的榛苗根系发育和枝叶生长良好,优于其他处理。榛苗品种(系)间栽植成活率和植株生长发育存在明显差异,86-104成活率高达95%,84-310仅为50.83%。在试剂处理和参试品种间,栽植成活率存在较明显的交互作用,处理间平均成活率低的品种个别处理成活率可高达100%,品种间平均成活率低的处理个别品种成活率也可高达100%。

新疆伊犁地区杂交榛生产现状与产业发展对策

平欧杂交榛是欧洲榛(Corylus avellana L.)与平榛(Corylus heterophylla Fisch.)杂交而成的优良品种。该研究在资料调研、农户调查并结合当地统计数据等综合分析的基础上,深入探究伊犁地区杂交榛子的生产现状、存在问题和发展优势等,并就伊犁地区杂交榛产业的区位优势、自然资源优势、产业结构调整及政策优势,提出更好地发展伊犁地区杂交榛产业的相应对策,为伊犁地区的榛子产业发展合理规划布局、栽培管理及开发利用提供参考依据。

平欧杂种榛达维与辽榛9号在宿州市的引种表现及栽培技术要点

榛子属于四大坚果之一,营养价值极高。平欧杂种榛为平榛、欧洲榛的杂交产物,既具有平榛果仁风味香、适应性强的特点,也具备欧洲榛出仁率高、果大的优势。栽培平欧杂种榛能够带来丰厚的经济效益和社会效益。本文介绍了平欧杂种榛达维与辽榛9号在宿州市的引种表现,分析了其栽培技术要点,以期为榛子产业稳定健康发展提供参考。

盐碱胁迫对平欧杂种榛枝条电阻抗图谱参数及离子含量的影响

为探讨平欧杂种榛枝条对盐碱胁迫的适应性，测定‘辽榛3号’当年生枝条在中性盐（NaCl）、碱性盐（Na2CO3）及混合盐3种盐碱胁迫下各项电阻抗图谱（EIS）参数的变化及主要矿质元素含量，分析各电阻抗参数及矿质离子含量的相关性,结果表明：随着NaCl浓度的增加，电阻抗参数高频电阻率（r）、低频电阻率（r1）、胞内电阻率（ri）和胞外电阻率（re）均表现出先降低后增加再降低的变化趋势；Na2CO3胁迫下，各参数则呈现持续上升的变化规律；混合盐碱胁迫下，r1、re随盐浓度增加持续降低，Na^＋含量在3种类型盐碱胁迫下均随浓度的增加而上升，且NaCl胁迫〉混合盐碱胁迫〉Na2CO3胁迫；Na2C03胁迫导致了Zn、B、Ca3种元素含量的降低．5种阳离子总量与r1、Le、弛豫时间（τ）、弛豫时间分布系数（ψ）呈显著负相关．平欧杂种榛枝条能耐200mmol·L^-1碱性盐胁迫，而对中性盐的忍耐能力介于100～150mmol·L^-1。

平欧杂种榛钙调蛋白基因ChaCaM的克隆与表达分析

以平欧杂种榛(Corylus heterophylla×C.avellana)品种‘达维’为材料,基于转录组测序数据,利用RACE技术克隆钙调蛋白基因,通过生物信息学进行序列预测分析,并利用实时荧光定量PCR技术分析其在不同组织和自交不亲和授粉后不同时间雌蕊中的表达模式。克隆获得一个钙调蛋白基因序列,命名为ChaCaM(Gen Bank登录号:KY211037),其开放阅读框为450 bp,编码149个氨基酸,分子量16.8476 kD。生物信息学分析表明,ChaCaM为酸性稳定蛋白,属于疏水性蛋白,无跨膜域和信号肽存在,主要定位于细胞质基质中,存在糖基化和磷酸化位点。序列分析表明,ChaCaM包含两个EFh结构域,与其他物种的CaM高度相似。系统进化树表明,ChaCaM与烟草、可可和萝卜等的CaM亲缘关系极近,聚类在同一分支下。基因表达分析表明,ChaCaM在平欧杂种榛不同组织中的表达具有差异,且在自交不亲和授粉后的雌蕊中具有明显的表达量变化。ChaCaM具有典型的钙调蛋白基因特征,主要定位于细胞质基质中;表现为组成型表达,推测其参与了榛属植物的自交不亲和反应。