黑龙江省和海南省稻瘟病菌中AVR-Pita家族的分布及变异分析

【目的】通过检测黑龙江省和海南省不同稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)菌株群体中AVR-Pita家族的分布情况和变异特征,了解其变异类型的致病表型,为区域内抗病种质的筛选与选育提供参考。【方法】通过参考NCBI中公布的AVR-Pita家族序列分别对启动子区和CDS区设计特异性引物共6对,对2020年采自黑龙江省和海南省不同地区的397个稻瘟病菌单孢菌株提取DNA,进行PCR扩增。通过电泳检测结果,分别选取囊括不同地区的代表菌株对扩增片段进行测序。测序结果与NCBI中相应的碱基与氨基酸序列进行比较分析,并利用水稻抗性单基因系,对不同变异类型的稻瘟病菌菌株进行无毒功能验证。【结果】在PCR电泳检测结果中,黑龙江省稻瘟病菌菌株携带所有待测基因,分布广泛且检出频率较高;而海南省稻瘟病菌菌株中仅携带AVR-Pita1和AVR-Pita2,并以低频率集中存在。无毒基因组成分析结果显示,黑龙江稻区的稻瘟病菌菌株复杂多样,携带的基因型种类较海南菌株丰富。PCR产物测序检测结果显示,AVR-Pita家族以点突变、插入和缺失为主要变异类型划分为19种,且不同稻瘟病菌群体来源的菌株,其变异类型具有特异性。AVR-Pita1检测出10种变异类型,其中AVR-Pita1-(1-5)为黑龙江省稻瘟病菌菌株独有的变异类型,AVR-Pita1-(6-10)为海南省稻瘟病菌菌株独有。对这10种变异类型经功能验证后发现,无毒功能均已丧失。AVR-Pita2检测出8种变异类型,其中AVR-Pita2-(1-4)为黑龙江省稻瘟病菌菌株独有,AVR-Pita2-(5-8)为海南省稻瘟病菌菌株独有。经功能验证后发现,无毒功能均已丧失。AVR-Pita3在黑龙江省仅检测出1种变异类型AVR-Pita3-1。【结论】黑龙江和海南稻瘟病菌群体中AVR-Pita家族均为突变后的等位基因型存在,经致病性鉴定后,检测出的所有突变类型均不能被相对应抗性基因Pi-ta和Pi-ta2所识别,表现为感病。因此,抗性基因Pi-ta和Pi-ta2在黑龙江省和海南省对稻瘟病的抗病育种与利用过程中可聚合其他抗性基因应用来保证品种抗病性。同时,不同地理来源的稻瘟病菌菌株群体中AVR-Pita家族的分布和变异类型具有特异性。

利用HRM功能标记检测黑龙江省水稻抗稻瘟病基因Pita和pik的基因型分布

为明确Pita及pik基因在黑龙江省水稻种质资源中的分布情况,本研究以67份黑龙江省主栽品种及优异种质资源作为试验材料,通过HRM技术,利用Pita及pik的HRM功能型分子标记Pita-G/T、Pik2-C/T,对67份材料进行基因分型。结果表明,67份种质中,含纯合Pita有27份,占参试种质的40.3%;纯合pik有22份,占参试种质的32.9%,同时含有两基因的为12份,比例为17.9%。综上,Pita-G/T及Pik2-C/T标记可以高效准确地对黑龙江水稻资源进行基因分型,同时,通过基因分型,明确了Pita及pik在黑龙江省的分布情况,为抗稻瘟病育种提供了理论基础。

菲律宾稻瘟病菌生理小种中AVR-Pita及其同源基因的序列与功能分析

根据已克隆的AVR-Pita及其同源基因序列设计4对引物,对来自菲律宾的74个稻瘟病单孢菌株DNA进行PCR扩增和序列分析,研究了与水稻抗病基因Pi-ta互作的稻瘟病菌无毒基因AVR-Pita及其同源基因序列多态性与进化关系。结果显示,在42个菌株中扩增出AVR-Pita1基因目的条带,31个菌株中扩增出AVR-Pita3基因目的条带,55个菌株中扩增出AVR-Pita4基因目的条带,但所有供试菌株均未扩增出AVR-Pita2基因目的条带。对PCR产物进行测序分析,发现AVR-Pita1基因在菲律宾的生理小种中存在序列多态性,可划分为5个单倍型,共有10个多态性位点;AVR-Pita3和AVR-Pita4基因序列较保守,序列比对后没有发现多态性。对不同单基因系接种鉴定,发现除第3种AVR-Pita1单倍型外,含有AVR-Pita1单倍型1、2、4及5的生理小种均不能与Pi-ta基因互作,从而使Pi-ta单基因系IRBLta-CT2在接种后表现为感病。以上试验结果说明AVR-Pita1基因变异性较强,且序列改变后会导致基因功能的变化。

黑龙江省稻瘟病菌无毒基因AVR-Pita及其同源基因的检测与分析

【目的】为了检测黑龙江省稻瘟病菌无毒基因AVR-Pita及其同源基因分布情况与变异机制,了解其变异类型的致病表型。【方法】采用3个无毒基因AVR-Pita1、AVR-Pita2和AVR-Pita3的特异性引物,对202个采自黑龙江省各稻区的稻瘟病菌单孢分离菌株的DNA进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳检测分析,挑选不同带型和不同地区代表菌株的PCR产物进行测序。测序结果与相应无毒基因序列进行碱基与氨基酸序列的比较分析,并利用水稻抗性单基因系,对不同变异类型的稻瘟病菌株进行功能验证【。结果】AVR-Pita1的出现频率为36.14%,AVR-Pita3出现频率为59.41%。AVR-Pita2在黑龙江省202个菌株DNA中未扩增出目的条带。对AVR-Pita1和AVR-Pita3的部分PCR产物进行序列分析,检测出AVR-Pita1有5种变异类型,它们是AVR-Pita1-1、AVR-Pita1-A、AVR-Pita1-B、AVR-Pita1-C和AVR-Pita1-D。经功能验证,AVR-Pita1-1、AVR-Pita1-A、AVR-Pita1-B和AVR-Pita1-D无毒功能丧失。而无毒基因AVR-Pita3未检测出变异菌株。【结论】AVR-Pita1变异能力较强,导致大多数菌株无毒功能丧失,需与其他抗性基因搭配使用。在黑龙江省稻瘟病菌生理小种中未发现AVR-Pita2基因。AVR-Pita3基因序列在菌株中比较稳定。

基于CRISPR/Cas9技术的水稻抗稻瘟病基因Pita突变体的创制

以粳稻品种‘日本晴’(Oryza sativa subsp.japonica‘Nipponbare’)为转基因受体,利用CRISPR/Cas9技术对抗稻瘟病基因Pita的第6至第25位碱基进行定点编辑,对突变体进行鉴定,筛选出不含T-DNA区的纯合突变体,并对该基因纯合突变体的稻瘟病抗性及6个稻瘟病病程相关基因的表达水平进行分析。结果表明:在获得的8株T0代阳性转基因植株中,有7株为突变体植株,包括1株杂合体和6株纯合体,突变率和纯合突变率分别为87.5%和85.7%,突变类型包括碱基置换、碱基插入和碱基缺失。通过PCR检测获得42株T1代T-DNA阴性植株,全部为纯合突变体。纯合突变体的稻瘟病抗性分析结果表明:接种稻瘟病菌小种CH199(Magnaporthe oryzae strain CH199)后,Pita基因编辑材料V1-38-5的T2代植株叶片病斑面积明显大于野生型‘日本晴’,平均病级为4.1±0.2,极显著(P<0.01)高于野生型‘日本晴’(3.0±0.2)。此外,与野生型‘日本晴’相比,V1-38-5的T2代植株PR2和PR1b基因的相对表达量在接种稻瘟病菌小种CH19912 h时较低,其PR2、PR1b、PR3和E2F基因的相对表达量在接种稻瘟病菌小种CH19924 h时也较低。研究结果显示:利用CRISPR/Cas9技术对水稻Pita基因进行定点编辑能够获得稳定遗传且更易感病的纯合突变体材料,这些材料可用于水稻抗性品种选育和品质改良,在一定程度上加速水稻定向分子育种的进程。

辽宁地区粳稻品种抗稻瘟病基因Pita的等位基因类型及其功能研究

Pita是最早被定位的抗稻瘟病基因之一,并广泛应用于世界各稻区的抗稻瘟病品种选育中。研究不同地区水稻品种中Pita等位基因的类型及其对田间流行病原菌的抗性对于水稻抗病育种具重要意义。本研究选用17份辽宁地区粳稻品种,通过对供试材料的Pita等位基因进行测序,发现该基因在这些品种中只有两种类型(Pita-A,Pita-B),他们之间存在7个单碱基突变(SNP),未发现插入缺失突变,这些突变导致5个氨基酸发生变化,没有导致基因表达的提前终止;通过人工接种鉴定,发现含有Pita-A的水稻抗病率仅为20%,而含有Pita-B的水稻抗病率高达70%,表明Pita-B对辽宁地区稻瘟病菌具一定抗病性,但当将Pita-B克隆并转化于感病品种辽星1号时,转基因T0代植株对同样的病原菌仍表现感病,进而表明单独携带Pita抗病基因的水稻品种对辽宁地区稻瘟病菌抗性较差,在进行抗病品种选育时,需与其它基因聚合使用,以提高品种的广谱抗性。

稻瘟病抗性基因Pita^2的克隆及其介导的防御相关基因表达分析

为了克隆位于水稻12号染色体着丝粒区域具有广谱抗性的稻瘟病抗性基因Pita^2,研究构建并筛选了该基因供体品种PiNo.4的Fosmid文库,构建Pita^2候选区域的物理图谱并互补验证了5个候选基因,克隆得到了稻瘟病抗性基因Pita^2,确认了该基因就是Ptr基因.一组基因型接近、对Pita^2致病性相反的稻瘟病菌菌株对水稻进行离体接种,接种前后相关防御基因的表达量分析结果表明,Pita^2基因在稻瘟病菌侵染后均成功激活了水杨酸和茉莉酸抗病信号通路,主要通过参与水稻水杨酸信号通路赋予水稻抗性,该研究为利用Pita^2培育持久广谱抗性水稻提供了一定的理论基础.

Genetic Analysis of Rice Mutants Identifi es a New Locus at the Pi-ta Region Controlling Pathogen Recognition

Understanding the molecular mechanisms of host and parasite interactions should facilitate the development of novel strategies to control plant diseases. Host interactions with biotrophic and hemi-biotrophic pathogens

一种高效便捷的水稻DNA提取法及其应用

以水稻叶片、根和种子为材料,采用高通量快速法提取基因组DNA,用稻瘟病Pita基因分子标记进行检测,获得与预期片段大小一致的特异性条带,对165份育种材料的检测结果与稻瘟病接种鉴定一致。操作方法如下:将少量水稻叶片、根或种子放入200μL PCR盘中,加入70μL缓冲液A(含NaOH和Tween20),在PCR仪中加热到95℃,保持10min,再加入70μL缓冲液B(Tris-HCl和EDTA),该提取液可以直接用于PCR扩增。该方法具有几个优点:1)成本低,仅用4种化学试剂,共140μL提取液;2)操作简便,仅需3步,每人每天可以提取上千份样品;3)仪器设备简单,只用常规的PCR仪;4)可直接提取干种子的DNA;5)DNA质量好,能检测出水稻中的抗稻瘟病单基因Pita,并且与稻瘟病接种鉴定结果一致;6)用量少,只需要5～20mg叶片、20mg根或半粒籽粒。尤其是检测大量样本的基因型时,此种方法更显得高效便捷。

聚合gs3、Pita及Pib基因创制长粒高抗稻瘟病核心粳稻种质

优质粳米的市场需求逐年增大,其中,长粒型粳米由于外观品质优异愈加受到市场青睐。中国的传统粳稻多为短圆粒型,通过引入长粒等位基因,改良短圆粒型粳稻的外观品质,并综合考虑稻瘟病抗性,创制长粒高抗稻瘟病粳稻核心种质意义重大。本研究以著名优质粳稻‘嘉禾212’为长粒gs3基因供体亲本,通过杂交、复交、标记辅助选择及花药培养有机结合的方式,开展了gs3及稻瘟病抗性基因Pita及Pib的聚合工作。研究结果表明,通过上述多种育种手段的有机结合,gs3,Pita及Pib基因被快速聚合,3份具有长粒抗稻瘟病特性的聚合系被成功创制;其中,改良系-2谷粒长宽比相比于圆粒粳稻亲本显著增大,垩白度显著降低,产量和稻瘟病抗性也保持较高水平,可作为长粒优质粳稻培育的核心种质。上述结果为以多基因聚合为目地的分子设计育种提供了理论依据。

稻瘟菌无毒基因的分子检测及其指纹类型分析

针对稻瘟菌中Avr-Pita与AvrPiz-t两个无毒基因,设计特异性引物,利用PCR方法对吉林省103株稻瘟菌菌株进行分子检测,并结合AVR-Pih、AVR-CO39、PWL2和ACE1 4个无毒基因在其中85个菌株中的分布情况,绘制出基于这6个无毒基因的指纹类型。结果表明,Avr-Pita基因和AvrPiz-t基因在吉林省稻瘟菌中的分布频率分别为86.41%和62.14%;建立的指纹类型显示,85株稻瘟菌分布于9种类型中,其中类型1为主要类型,其分布频率为40.00%;根据30个已知生理小种的菌株在指纹类型中的分布情况,初步发现类型7与吉林省优势生理小种ZE1可能存在对应关系,并应用于稻瘟菌优势生理小种的特异性分子检测;其他指纹类型与中国生理小种并无明显对应关系。明确了无毒基因Avr-Pita与AvrPiz-t在吉林省稻瘟菌中的分布情况,构建了无毒基因的指纹类型,为水稻抗瘟育种和稻瘟菌优势小种的分子监测提供理论依据。

稻瘟病抗性基因Pita在中日韩粳稻中的分布

为了解2 350份来源中国、日本和韩国粳稻品种(系)稻瘟病抗性基因Pita的分布,利用2个KASP分子标记对该基因进行了检测,605份材料表现有利,1 732份不利,7份为杂合,6份不确定。在有利、不利和杂合三个群体中分别随机选取316份、101份和7份材料,对Pita基因功能片段进行了测序分析,结果显示有利群体中KASP检测结果准确率为95.89%,不利群体100%,2个KASP分子标记可以用来联合检测水稻种质资源的Pita抗性基因。根据KASP分子标记检测结果,在中国北方地方稻种中仅0.69%品种携带Pita抗性基因,在中国13个省区市育成品种(系)和日本韩国外来稻种中均有一定的分布,频率7.02%~55.81%,表明Pita基因在东亚地区范围内均得到了一定的应用,但各地区应用程度相差较大,其中中国吉林、辽宁、宁夏、浙江四省地区较高。通过415份材料Pita基因功能片段609个碱基序列的比较,仅发现3个变异位点(第2 388位,第2 752位,第2 766位)和4种基因单倍型,其中抗性基因仅一种单倍型(H1),感病基因有三种单倍型(H2, H3, H4),H2为优势单倍型(84.84%)。本研究结果为开发和利用中日韩地区稻种资源和品种布局提供了依据。

贵州地方水稻品种抗稻瘟病基因Pita功能区段序列变异分析

为了揭示贵州水稻地方品种Pita基因序列变异类型和地理分布特点,以贵州省收集到的91份地方水稻品种为供试材料,设计抗稻瘟病Pita基因特异引物对Pita基因第二编码区功能位点区段进行PCR扩增及测序分析。研究表明,91份贵州地方水稻均持有抗稻瘟病Pita基因,DNA序列存在6个变异位点,氨基酸序列存在4个变异位点,归为7种DNA单倍型和5种蛋白型,其中Pita-H1(63.74%)、Pita-H2(18.68%)的频率较高,是贵州的优势单倍型,其他单倍型频率较低。携带Pita抗性基因(编码区第2 752位功能位点碱基为G)的品种仅6个,占供试材料的6.59%,且与越南抗性品种Tetep序列一致。Pita抗性基因在贵州省广泛分布不平衡,且频率较低。本研究为挖掘和利用贵州地方稻种的抗稻瘟病基因资源提供了参考。

分子标记辅助选育聚合抗稻瘟病基因Pi5及Pita的水稻新品系

稻瘟病是对水稻生产具有严重威胁的真菌病害,选育并推广聚合多个抗稻瘟病基因的抗病品种是防控该病最为经济有效的途径。本研究以携带不同抗稻瘟病基因的‘吉粳105’(Pita)和‘T639’(Pi5)为亲本杂交衍生的后代群体为试材,利用分子标记辅助育种技术,筛选到3个聚合抗稻瘟病基因Pita和Pi5的后代。并以其中一个株系‘吉2011TK50’为试验材料,利用人工接种鉴定、显微观察及定量PCR等技术研究‘吉2011TK50’的抗病表型及抗性分子机制。结果表明,抗稻瘟病基因的聚合能够增强该品系对稻瘟病的抗性。显微观察和抗稻瘟病基因表达分析发现,基因聚合株系在接种稻瘟病菌后24 h PR基因表达量显著升高,被稻瘟病菌侵染的细胞开始出现过敏性死亡等抗病反应,抑制了稻瘟病菌的进一步侵染。研究结果证实聚合Pita和Pi5可提高水稻品种对抗稻瘟病的抗性,这可为抗病基因聚合育种提供参考。