鸡Piwi蛋白的亚细胞定位研究

通过构建2种真核表达载体比较Piwi蛋白在真核细胞中的表达部位,为进一步研究Piwi蛋白的生物学功能提供依据。采用RT-PCR方法克隆了狼山鸡睾丸组织中Piwi基因CDS,构建含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的融合表达载体pEGFP-C1-Piwi,脂质体PEI介导基因转染NIH-3T3细胞,同时构建pcDNA3.1-Piwi真核表达载体,采用细胞间接免疫荧光方法检测Piwi蛋白在NIH-3T3细胞的表达部位。结果表明,成功克隆出公鸡Piwi基因的全序列CDS,大小为2 604bp,与GenBank中预计的序列基本一致;融合表达载体pEGFP-C1-Piwi在整个细胞中都有表达;而间接免疫荧光方法检测到pcDNA3.1-Piwi载体主要在NIH-3T3细胞质中表达。Piwi蛋白主要在细胞质中表达,采用间接免疫荧光方法比EGFP报告基因法更为可靠,适合目的蛋白的亚细胞定位研究。

PIWIL1在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的:探讨干细胞相关蛋白PIWI样蛋白1(PIWI-like protein-1,PIWIL1)在肝细胞癌组织中的表达及临床意义,并探索其表达与患者预后的关系.方法:应用免疫组织化学检测47例肝细胞癌标本中PIWIL1的表达,免疫印迹(Western blot)法检测31例肝细胞癌组织中PIWIL1的表达,分析PIWIL1表达与临床特征及预后的关系.结果:PIWIL1在肝癌组织中高表达,在正常肝组织中低表达,PIWIL1同肿瘤分化程度、有无临近组织侵犯有关,与肿瘤大小及甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)水平无关;其阳性表达预示患者预后较差.结论:PIWIL1的高表达同病理分化程度、临近组织侵犯相关及患者预后相关.

PIWI和肿瘤

PIWI家族成员包含保守的PAZ和PIWI区域,在干细胞自我更新、精子发生、RNA干扰和翻译调控中扮演重要角色。最近研究发现,一些PIWI在肿瘤中呈特异性表达,并与肿瘤的发生、发展相关。PIWI将有可能成为肿瘤诊断和预后判断的一个新的重要指标。研究PIWI表达调控机制,可探讨PIWI在肿瘤基因治疗方面的可行性。

Piwi蛋白与基因的表达调控及其在肿瘤中的作用

Piwi蛋白是Argonaute蛋白家族的一类,正常情况下可表达于不同物种的雄性睾丸组织中,主要与Piwi相关RNA(piRNA)相互作用,导致转座子基因的沉默,保护生殖干细胞基因组的稳定性和完整性,对生殖干细胞的自我更新、配子和胚胎的发育具有重要的作用。另外,在人类多种肿瘤组织如胃癌、乳腺癌、宫颈癌中发现有Piwi蛋白表达,同时在肿瘤干细胞中也有Piwi蛋白的表达,抑制其表达可通过多种不同机制抑制肿瘤细胞的增殖和凋亡,说明Piwi蛋白与肿瘤的发生发展有关。现就Piwi蛋白调控基因表达及其与肿瘤发生发展的关系作一综述。

Piwi-interacting RNA在肿瘤中的研究进展

piRNA（Piwi—interactingRNA）是一类长度为26～31nt的新型小非编码RNA，可与PIWI蛋白结合从而调控转录基因沉默过程、修饰异染色质和维持生殖系和干细胞功能等。近年来，研究发现piRNA在多种癌组织中表达异常，与肿瘤的发生及扩散、疾病的预后等密切相关，有望成为肿瘤临床诊断和治疗的新靶点。本文旨在浅析piRNA在肿瘤中的作用机制，为临床诊疗提供新思路。

家蚕Piwi亚家族基因的克隆、表达及进化分析

为克隆家蚕Bombyx mori Piwi亚家族蛋白基因cDNA全长序列,分析其分子特征和表达模式,探究Piwi亚家族蛋白在家蚕中的生理功能,本研究利用已知物种的Piwi亚家族蛋白搜索家蚕基因组,预测获得家蚕Piwi亚家族蛋白基因siwi1和siwi2,采用RACE技术克隆siwi1和siwi2的全长cDNA序列,利用ORFfinder、Gene-Explorer、InterPro等分析其分子特征;其次,利用已知的所有物种Piwi蛋白及其类似物Piwil构建系统发育树;最后,通过荧光定量PCR技术检测了siwi1和siwi2在丝腺、马氏管、中肠、头部、卵巢和精巢以及不同发育时期(卵、1~5龄幼虫、蛹、成虫)的表达水平,结果显示,克隆获得了siwi1 cDNA全长3277 bp,包含部分5′UTR、完整的开放阅读框ORF和3′UTR,获得了siwi2的部分序列,其中siwi1对应BmPiwi,siwi2对应BmAgo3。系统发育结果显示,家蚕Piwi亚家族蛋白与乳草长蝽Oncopeltus fasciatus、黑腹果蝇Drosophila melanogaster、橘小实蝇Bactrocera dorsalis、优雅蝈螽Gampsocleis gratiosa、斯氏按蚊Anopheles stephensi、褐飞虱Nilaparvata lugens的PIWI蛋白以及东亚飞蝗Locusta migratoria的PIWI2和PIWI3蛋白亲缘关系最近,和三疣梭子蟹Portunus trituberculatus的PIWI2和PIWI3同为一支。家蚕AGO3蛋白与小菜蛾Plutella xylostella的AGO3亲缘关系最近,与西方玉米根虫Diabrotica virgifera virgifera、白蜡窄吉丁Agrilus planipennis的AGO3及东亚飞蝗Locusta migratoria的PIWI1同属一支,与橘小实蝇Bactrocera dorsalis的AGO3同属一总支。组织表达结果表明BmPiwi在精巢表达水平显著高于其他组织,其次是卵巢及头部,而BmAgo3在头部表达水平显著高于其他组织。BmPiwi和BmAgo3在卵期表达量最高,但在初孵幼虫中表达量迅速下降,并在整个幼虫时期都维持低表达状态,直至蛹期开始表达量出现大幅回升,并维持高水平表达至成虫期。本研究发现BmPiwi和BmAgo3在家蚕中的表达具有明显的时空特异性,在生殖组织以及需要进行大量细胞活动的时期,家蚕Piwi亚家族蛋白基因的表达均发生了明显的变化,为进一步探测家蚕Piwi亚家族的生理功能提供了研究方向和理论基础。

piRNA通路与精子发生的研究进展

与PIWI蛋白相互作用的RNA(piRNA)是一类动物生殖系细胞特异性表达的小分子非编码RNA。本文从piRNA分子、PIWI蛋白及其他相关蛋白3个方面系统概括了piRNA通路。发现piRNA通路不仅通过抑制转座子机制,还可以通过调控翻译、生殖系干细胞的维护、RNA的降解、基因防御等方面来影响精子发生。因此对piRNA通路在精子发生中的最新研究进展进行了综述。

利用家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统在BmN细胞中可溶性表达PRG-1蛋白(英文)

杆状病毒Bac-to-Bac表达系统由于操作简便等优点,被广泛应用于外源蛋白的表达。利用新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac系统可溶性表达一个大分子质量的融合蛋白———piwi相关基因编码蛋白PRG-1。为了提高目的蛋白的表达量,对重组病毒感染剂量及产物收获时间进行优化,并利用GST亲和层析纯化融合蛋白。结果表明在家蚕卵巢培养细胞BmN中表达的重组GST-PRG-1是可溶性蛋白;最佳的感染条件是病毒粒子对BmN细胞的感染复数(MOI)=1,并在感染后96 h收获细胞。试验结果表明,新构建的家蚕核型多角体病毒Bac-to-Bac表达系统可用于大分子蛋白的可溶性表达。

piRNA的形成及其在雌性动物中生物学功能研究进展

piRNA是继siRNA和miRNA之后发现的一类新型非编码小RNA,其与Piwi蛋白协同作用参与piRNA通路,保护动物生殖细胞的遗传信息免受分子寄生虫如转座子的有害影响。近年来,人们对piRNA发生过程的相关蛋白及生物学作用做了研究,发现多种Piwi亚家族蛋白能与piRNA结合形成Piwi-piRNA复合体,通过表观遗传调控参与生殖细胞形成与发育、生殖干细胞分化、性别决定等生物学功能。本文主要围绕piRNA的形成及特点、Piwi-piRNA复合体发挥生物学作用的方式、piRNA在雌性动物中的生物学功能这3个方面对近期的研究进展进行综述,为深入探究piRNA调控雌性动物繁殖机制提供参考。

非编码RNAs在人牙髓干细胞中的调控作用及机制

背景:人牙髓干细胞是一种重要的口腔间充质干细胞,具有很强增殖和多向分化能力。随着人类基因组计划的不断深入,人们逐渐意识到功能性非编码RNAs在调节基因表达方面有着至关重要的作用。目的:对非编码RNAs在人牙髓干细胞中的研究进展进行论述。方法:由第一作者以“ncRNAs,human dental pulp stem cell,regenerative medicine”为英文关键词,以“长链非编码RNAs,人牙髓干细胞,再生医学”为中文关键词,检索2005至2019年期间收录在PubMed、Medline、中国知网、万方等数据库中的文献,排除与文章研究目的无关及重复性的文献,纳入符合标准的71篇文献进行综述。结果与结论:目前普遍认为,非编码RNAs可以作为特定细胞状态的信号,为临床提供预后价值,甚至为患者提供治疗选择。随着再生医学应用的不断发展,人牙髓干细胞将越来越受到关注,研究非编码RNAs与人牙髓干细胞的关系,将为人牙髓干细胞的临床应用研究寻觅了一条新的途径。

piRNA在小鼠雄性生殖系统中的起源与功能

PIWI相互作用RNA（pi RNA）是2006年新发现的一种24-32个碱基长度的非编码小RNA。pi RNA与生殖特异的PIWI蛋白结合,在生殖系统的发育中起重要作用。雄性小鼠的生殖系统中,基因组中pi RNA簇和转座子区域转录出pi RNA前体,pi RNA前体出核后在初级生成途径和次级生成途径下生成成熟的pi RNA。成熟pi RNA首先能够沉默逆转座子转录出的RNA,降低转座子的活跃度,从而维持基因稳定,维持生殖细胞的正常发育。另外pi RNA还具有调节基因表达的功能,在转录水平和转录后水平上参与精子发生。

piRNA对生殖系统调控作用的研究进展

随着小RNA研究的不断深入,科学家们发现了新型内源性小RNA——piRNA,与生殖细胞发育密切相关。piRNA是大约为32 nt长度的非编码小RNA,主要分布于哺乳动物卵巢卵母细胞和睾丸精原细胞中,在果蝇的卵巢卵泡(性腺体细胞)中也存在少量的piRNA。piRNA的生成及生物功能的发挥均依赖Argonaute家族Piwi蛋白,piRNA与Piwi亚家族蛋白特异性相结合并相互作用。研究发现,在体细胞和生殖细胞中piRNA的生成途径不同。piRNA主要在生殖干细胞分化、胚胎发育、DNA完整性的保持、表观遗传调控和性别决定等方面发挥作用。文章简单综述了piRNA在哺乳动物生殖系统发育过程中的调控机制。

piRNA/PIWI在头颈部鳞状细胞癌中的研究进展

piRNA属于小的单链RNA,其5'端含有一个单磷酸基和强尿嘧啶偏向性,其3'端2-OH被甲基化。通常与PIWI蛋白家族成员结合来发挥调节功能。诸多研究表明piRNA/PIWI在多种恶性肿瘤中表达改变预示着截然不同的临床结果,可能作为头颈部鳞状细胞癌发生发展过程中的潜在生物标志物或治疗靶点。鉴于piRNA/PIWI在头颈部鳞状细胞癌中的功能意义仍然未知,本文对piRNA/PIWI的生物功能及其在头颈部鳞状细胞癌中的作用进行综述,旨在为头颈部鳞状细胞癌的诊断及治疗开辟新思路,以期实现肿瘤的早期检测和治疗干预。

基于小RNA测序和数据库比对探究PRMT1调控的sncRNAs在哮喘中的作用

小非编码RNA(small non-coding RNA,sncRNA)包括microRNA(miRNA)和PIWI蛋白互作RNA(PIWI-interacting RNA,piRNAs),其异常表达参与支气管哮喘(简称哮喘)气道上皮炎症过程。目前的研究多基于哮喘相关sncRNA的异常表达功能研究,少有对sncRNA表达变化原因的探究。我们前期的研究发现,蛋白质精氨酸甲基转移酶1(protein arginine methyltransferase 1,PRMT1)作为哮喘标志性分子,参与上皮细胞炎症的发生和气道下重塑。本文利用过表达人肺上皮细胞BEAS-2B中哮喘标志性基因PRMT1,进行sncRNA深度测序并与哮喘数据库联合分析,将差异表达的sncRNA与5个Gene Expression Omnibus(GEO)测序数据集进行比较,发现23种PRMT1调控的哮喘相关的sncRNA。利用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证,筛选出12种miRNA和2种piRNA。将这些sncRNA靶基因与哮喘病人生成的上皮细胞样本mRNA测序结果(GSE18965和GSE43696)进行交叉比对,初步确定哮喘相关基因,并进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)预测。分析表明,哮喘相关sncRNA主要靶标是Ras/Rap1-MAPK信号通路,包含53种靶基因。本研究通过小RNA测序(small RNA Seq)技术探寻PRMT1调控的下游sncRNA,比对现有的数据库,识别出PRMT1调节的sncRNA及其目标信号通路Ras/Rap1-MAPK,为哮喘的发病机制研究提供了新的sncRNA分子和信号通路靶点。

PIWIL2蛋白在肝门部胆管癌组织和细胞株中的表达及临床意义

目的研究PIWIL2在肝门部胆管癌组织和细胞株中的表达及其与临床病理特征和根治性切除术预后的关系。方法采用免疫组织化学方法检测41例肝门部胆管癌和10例正常胆管组织中PIWIL2的表达；蛋白印迹和细胞免疫荧光技术检测人胆管癌细胞系QBC939和人正常胆管上皮细胞HIBEpic株中PIWIL2的表达。采用Kaplan—Meier法对胆管癌根治术后患者进行生存期的单因素及多因素分析。结果PIWIL2在肝门部胆管癌和QBC939细胞中的表达明显高于对照组织和HIBEpie细胞（P〈0．05）；PIWIL2在低、中分化胆管腺癌的表达明显高于高分化腺癌（P〈0．05）。单因素生存分析显示根治术后PIWIL2高表达的生存期较短（P〈0．05）。多因素分析显示PIWIL2的表达水平是影响胆管癌根治术预后的独立危险因素（P〈0．05）。结论PIWIL2在肝门部胆管癌组织和细胞系中表达上调，其表达水平与肿瘤分期及分化程度相关，是影响肝门部胆管癌根治切除预后的独立危险因素。

PIWI样蛋白4在肝癌中的表达及其对细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

目的 探讨PIWI样蛋白4（PIWIL4）在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义,并观察其对肝癌细胞LM3增殖、迁移及侵袭能力的影响.方法 应用免疫组织化学法检测49例肝细胞癌标本及其配对癌旁组织PIWIL4的表达并分析其与临床病理特征的关系;构建人PIWIL4慢病毒表达载体并转染LM3肝癌细胞,采用噻唑蓝（MTT）和Transwell实验等方法观察其与对照组比较增殖、迁移及侵袭能力的变化.结果 PIWIL4在肝细胞癌组织中高表达（43/49）,在癌旁组织（37/49）及正常肝组织（8/15）中表达较低（P＜0.05）,PIWIL4同肿瘤分化程度、肿瘤大小及甲胎蛋白（AFP）水平明显相关（P＜0.05）;在体外实验显示慢病毒转染的PIWIL4高表达LM3细胞增殖、迁移及侵袭能力明显增强（P＜0.05）,过表达组及对照组发生迁移的细胞数分别为（349.3 ±27.4）个比（75.7±16.4）个（P＜0.05）.结论 PIWIL4表达与肝癌的发生、发展密切相关,其表达上调可明显增强肝癌细胞增殖、迁移及侵袭能力.

PIWILl蛋白与DICER酶在肝细胞癌中的表达及意义

目的探讨P1WIL1蛋白与DICER酶在肝细胞癌组织中的表达及临床意义。方法免疫组化检测47例肝细胞癌标本中PIWILl与DICER的表达。蛋白印迹法检测31例肝细胞癌组织中PIWILl与DICER的表达。分析PIWIL1与DICER表达及与临床特征的关系。结果P1WIL1在癌组织中高表达，在正常肝组织中低表达（P〈O．05）。DICER在正常肝组织中高表达，在癌组织中低表达或缺失（P〈0．05）。PIWILl和DICER与肿瘤分化程度、临近组织侵犯相关（P〈O．05），PIWIL1与DICER在组织中的表达呈负相关（P〈0．05）。结论PIWILl的高表达和DICER的低表达或缺失与病理分化程度及临近组织侵犯相关，PIWILl与DICER的表达负相关。

空腹血糖与piR-30715的交互作用对胃癌术后患者预后的影响

该文旨在探讨空腹血糖和PIWI蛋白相互作用RNA 30715(PIWI interacting RNA-30715,piR-30715)与胃癌预后的关系。于2014年9月~2016年10月,收集福建省肿瘤医院收治的66例接受根治性胃切除术的胃癌患者。分析癌组织及癌旁组织的piR-30715、PIWI样蛋白4(PIWI-like 4,PIWIL4)表达情况;Kaplan-Meier生存曲线分析空腹血糖、piR-30715、PIWIL4与胃癌术后患者预后的关系;COX回归分析空腹血糖升高和piR-30715对胃癌术后患者预后的交互作用。与癌旁组织比,癌组织的piR-30715、PIWIL4阳性表达例数明显增高(P<0.05)。随访截止到2020年12月31日,66例胃癌随访时间为1.25~75.73个月,中位随访时间为57.05个月。66例胃癌患者中,25例(37.88%)死亡,41例(62.12%)存活。单因素分析显示,空腹血糖(OR=1.965,P<0.001)、piR-30715(OR=2.002,P=0.016)、PIWIL4阳性(OR=2.683,P=0.018)、分期(tumor node metastasis,TNM)(OR=5.755,P=0.018)、远处转移(OR=4.693,P=0.003)及淋巴结转移(OR=3.654,P=0.036)均与胃癌患者预后相关。COX分析显示,空腹血糖升高和piR-30715高表达是胃癌预后的独立危险因素(P<0.05)。生存分析显示,高空腹血糖组和piR-30715高表达组的胃癌患者的总体生存率较低(P<0.05)。空腹血糖和piR-30715对胃癌预后存在相乘交互作用(P相乘=0.003),无相加交互作用(P>0.05)。空腹血糖升高和piR-30715高表达是胃癌预后的独立危险因素,空腹血糖升高与piR-30715高表达对胃癌预后有相乘交互作用。

Argonaute蛋白家族在RNAi中的作用

RNA干扰是一种双链RNA诱导的基因沉默现象。Argonaute蛋白组成了一个高度保守的家族,该蛋白家族包括许多成员,它们组成了RNA诱导的沉默复合体的核心元件,是RNA干扰所必须的。Argo-naute蛋白选择性地与miRNA和siRNA结合,并与Dicer酶相互作用,其PIWI盒子与Dicer的RNaseⅢ结构域直接相互作用,PIWI与Dicer之间的相互作用可能会促进miRNA/siRNA的释放。Argonaute蛋白很可能是RNA干扰中核酸内切酶活性的执行者。

piRNA通路中调控蛋白质研究进展

piRNA是一类与Argonaute蛋白家族的PIWI亚家族蛋白结合的非编码小RNA,其在沉默转座子、维持基因组的稳定性和保证生物体生殖细胞的正常发育中起着重要作用。piRNA通路包括piRNA的生成、piRISC的形成,以及由piRISC介导的转座子沉默。现总结了目前发现的参与调控果蝇和小鼠中piRNA通路的蛋白质因子。