恒河猴piwil4基因的鉴定与表达分析

为了研究人类近亲恒河猴中PIWI家族蛋白PIWIL4的结构和表达情况,文章首次利用同源比对和RT-PCR方法克隆了恒河猴piwil4基因,检测了其mRNA在恒河猴心脏、脑、结肠、附睾和睾丸5种组织中的表达情况,利用生物信息学的方法对恒河猴piwil4基因和人的PIWIL4(HIWI2)基因编码的蛋白产物进行了同源性分析和结构域分析,并进一步利用免疫组化的方法比较了PIWIL4蛋白在成人、成年恒河猴和性未成熟恒河猴睾丸组织中的表达分布。结果表明,恒河猴piwil4 mRNA在多组织中表达,恒河猴和人的PIWIL4蛋白的氨基酸序列同源性达97%以上,均含有PAZ和Piwi结构域,它们在两物种成年个体睾丸组织中空间分布一致,但在不同发育阶段恒河猴睾丸组织中的分布发生了改变,幼猴中PIWIL4蛋白主要表达于生精小管细胞的细胞核,在成年猴睾丸组织中则表达于各种细胞的胞浆中。上述结果提示,piwil4基因在人类和恒河猴精子发生过程中作用类似,PIWIL4蛋白在幼猴和成年猴睾丸组织中的表达差异提示它们在不同发育阶段功能的改变。

舌鳞癌组织中肿瘤干细胞的分离培养及PIWIL4对其的影响

目的从人舌鳞癌组织中分离培养肿瘤干细胞细胞(CSC),鉴定其生物学特性,并研究PIWIL4在CSC中的表达和意义。方法收集9例不同临床分期舌鳞癌患者组织标本,通过酶消化和原代培养相结合等方法处理,采用无血清悬浮培养法分离培养获得含CSC的悬浮细胞球,流式细胞仪检测细胞表面分子标志CD133和CD44的表达,免疫磁珠分选系统分离CD133+CD44+细胞;采用半定量逆转录聚合酶链反应检测PIWIL4 mRNA在CSC中的表达;裸鼠皮下接种CSC,观察其成瘤能力。结果成功的从人舌鳞癌组织分离培养获得可悬浮生长、稳定传代的CSC,CSC高表达CD133和CD44,裸鼠皮下接种1×104、1×105个CSC均可全部成瘤,PIWIL4 mRNA在CSC的表达也显著高于正常舌组织细胞。结论采用无血清悬浮培养法成功从人舌组织中分离获得CSC,具有肿瘤干细胞特性,能高度表达PIWIL4,为靶向肿瘤干细胞的治疗提供了实验依据。

PIWIL4在肝门部胆管癌中的mRNA及蛋白表达

目的探讨PIWIL4在肝门部胆管癌(HCCA)中的m RNA及蛋白表达。方法收集经我院病理学检查确诊为HCCA的癌组织及癌旁(>1 cm)组织手术切除标本40例,采用聚合酶链反应(RT-PCR)及Western-blot印迹检测PIWIL4 m RNA和蛋白在癌组织及癌旁组织中的相对表达情况,并分析其与临床病理因素间的关系。结果 (1)40例样本中26例癌组织的PIWIL4表达明显高于癌旁组织,6例癌组织与癌旁组织差异不明显,8例癌组织中PIWIL4的表达低于癌旁组织。癌组织中PIWIL4的m RNA相对表达量高于癌旁组织(P<0.05)。(2)40例样本中26例患者肿瘤中的PIWIL4蛋白表达水平高于癌旁组织,14例患者肿瘤中的PIWIL4蛋白表达水平与癌旁组织差异不明显。(3)PIWIL4蛋白表达水平与肿瘤分化程度、肝内转移及门静脉癌栓有关(P<0.05)。结论 HCCA癌组织中PIWIL4基因处于激活状态,可将其作为一个诊治HCCA的新的靶点,且PIWIL4蛋白表达水平的增加可能与HCCA肿瘤恶性程度密切相关。

肝门部胆管癌组织中PIWIL4蛋白表达及其临床意义

目的:探究肝门部胆管癌组织中PIWIL4蛋白表达情况,并分析其与临床病理因素的相关性。方法:选取医院经手术切除的40例肝门部胆管癌组织及癌旁组织为实验标本,选用SP免疫组化法检测上述实验标本中PIWIL4蛋白表达情况,并探究其与各病理因素的关系。结果:肝门部胆管癌组织中PIWIL4蛋白阳性率60.0%,显著高于癌旁组织(P<0.05);肝门部胆管癌组织中PIWIL4蛋白表达水平均与TNM分期、淋巴结是否转移、细胞分化程度差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PIWIL4基因在肝门部胆管癌组织中呈高表达,且PIWIL4蛋白表达上调在肝门部胆管癌中的发生、发展及预后中发挥着重要的作用,可将其作为判断肝门部胆管癌病情进展的主要指标之一。

PIWIL4在人卵巢癌中的表达及其功能研究

采用半定量RT-PCR方法检测人卵巢透明细胞癌ES-2细胞中PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3、PIWIL4 mRNA表达水平,以及PIWIL4在卵巢癌组织和癌旁正常组织中的表达情况.设计并化学合成针对PIWIL4的siRNA,用脂质体转染法将其转入ES-2细胞内,通过MTT和克隆形成实验,观察PIWIL4-siRNA对ES-2细胞生长活性和增殖能力的影响.半定量RT-PCR实验结果发现,ES-2细胞中,PIWIL4相对PIWIL1、PIWIL2、PIWIL3,其表达水平最高(P<0.05),而且PIWIL4在卵巢癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P<0.01).MTT实验和克隆形成实验结果显示,转染PIWIL4-siRNA的ES-2细胞生长活性和克隆形成率明显低于对照组(P<0.05).由此得出结论:PIWIL4在卵巢癌细胞系ES-2细胞表达较高,且它在卵巢癌组织中的表达明显上调,同时PIWIL4-siRNA可有效抑制ES-2细胞的生长活性和增殖能力,提示PIWIL4可能与卵巢癌发生、发展相关.

胃癌组织中piR-9994的表达及其与PIWIL4表达的相关性

目的探讨piR-9994在胃癌中的表达及其与临床病理特征的关系,并分析其与PIWIL4表达的相关性。方法采用qRT-PCR法检测76例胃癌及癌旁组织中piR-9994的表达,采用免疫组化En Vision法检测PIWIL4的表达,并复习相关文献。结果 piR-9994在胃癌组织中的表达比癌旁组织上调2. 3倍(P=0. 002 2)。Ⅲ+Ⅳ期胃癌组piR-9994的表达比Ⅰ+Ⅱ期胃癌组上调3. 5倍(P=0. 002),神经侵犯组比未侵犯组上升2. 5倍(P=0. 036)。PIWIL4在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织(χ2=18. 346,P <0. 001),其中Ⅲ+Ⅳ期胃癌组高于Ⅰ+Ⅱ期胃癌组(χ2=8. 60,P=0. 003)。胃癌组织中piR-9994的表达与PIWIL4表达呈正相关(r=0. 231,P <0. 05)。结论 piR-9994在胃癌组织中过表达并与肿瘤分期、神经侵犯密切相关,piR-9994可能通过调节PIWIL4表达促进胃癌的发生、发展,piR-9994有望成为判断胃癌恶性程度及预后的分子标志物。

EBV相关性胃癌中PIWIL1和PIWIL4表达及与预后的相关性

目的探讨PIWIL1和PIWIL4表达与EBV相关性胃癌(EBV-associated gastric cancer,EBVaGC)临床病理学特征及预后的关系。方法收集胃腺癌111例,采用原位杂交技术鉴定EBVaGC,应用qRT-PCR检测正常胃黏膜上皮细胞株GES-1、EBV阴性胃癌细胞株MKN-28、EBV感染的胃癌细胞株AGS-BX1、胃腺癌组织及癌旁组织中PIWIL1和PIWIL4的表达,并分析其与临床病理特征的相关性;Kaplan-Meier和Logistic以及Cox分析PIWIL1和PIWIL4表达与EBVaGC预后的相关性。结果PIWIL1与PIWIL4在EBVaGC组中的表达均高于非EBV相关性胃癌(non-EBV-associated gastric cancer,EBVnGC)组(P<0.05)。PIWIL1和PIWIL4在EBVaGC中的表达量分别为0.556±0.096、0.778±0.440,在癌旁组织中的表达量为0.240±0.121、0.501±0.431,分别上调2.31倍及1.55倍(P=0.033,P=0.029)。AGS-BX1中PIWIL1与PIWIL4表达水平高于GES-1和MKN-28(P<0.01)。PIWIL1和PIWIL4表达与胃腺癌TNM分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。Kaplan-Meier分析结果显示,PIWIL4高表达组患者的总生存期较低表达组差(P=0.007)。Logistic及Cox分析显示PIWIL4表达与EBVaGC的预后相关(P<0.05),是EBVaGC预后独立危险因素。结论EBVaGC中PIWIL1和PIWIL4过表达,并与TNM分期和淋巴结转移密切相关,且PIWIL4与患者总生存期相关,是EBVaGC预后的独立危险因素,PIWIL4可能是判断EBVaGC预后的分子标志物。

大鼠肝癌模型中Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA和蛋白表达水平及其与肿瘤检测的关系

PIWI和piRNA的表达水平与肿瘤类型密切相关。Piwil2 mRNA在肝癌中的表达量比肿瘤周围的肝脏组织的表达量高。PIWI/piRNA通路基因Piwil4、Mael和Ddx4为候选癌基因,在多种癌组织中表达,而在肝癌组织中的研究尚无报道。为探讨Piwil4、Mael和Ddx4基因在肝癌组织中表达水平变化的影响,建立了大鼠肝癌模型,并提取血清用ELISA方法检测肿瘤标记物,采用实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹方法和免疫组织化学方法检测正常肝组织与模型组肝组织中Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA转录和蛋白表达水平。结果表明,大鼠肝癌动物模型血清中肿瘤标记物含量明显升高。Piwil4、Mael和Ddx4基因mRNA及蛋白在肝癌模型组织中高表达。研究表明,肝癌模型组织中Piwil4、Mael和Ddx4基因表达水平有望作为肝癌检测的一种分子标志物。

PIWIL4的克隆及其抗体制备和初步应用

目的制备兔抗人PIWIL4的多克隆抗体，鉴定其特异性，并应用该抗体检测内源性PIWIL4在人各细胞系中的表达差异及细胞定位。方法构建原核表达质粒pGEX-5X-1．PIWIL4，转化大肠杆菌BL21，PIWIL4蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。融合蛋白通过切胶纯化后免疫家兔制备抗体血清。以间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体效价，Westernblot鉴定抗体特异性及检测PIWIL4在各细胞系中的表达差异，免疫荧光染色观察PIWIL4的细胞定位。结果成功构建原核表达质粒，表达并纯化PIWIL4蛋白。免疫大白兔后得到PIWIL4多克隆抗体，ELISA检测抗体效价为1：20000，Westernblot和免疫组化确定抗体具有高度特异性，并成功地应用该抗体检测到PIWIL4在人多种细胞系中的表达差异及细胞定位。结论PIWIL4蛋白及其多克隆抗体的成功制备，为进一步研究PIWIL4的生物学功能奠定了基础。

Piwil4基因敲除对HBV感染诱发肝癌细胞模型的抑制作用及相关机制

目的分析Piwil4基因敲除抑制乙型肝炎病毒(HBV)感染诱发肝癌细胞模型的相关机制。方法选取HBV全长的稳定肝癌细胞系HepG2.2.15作为HBV感染所诱发的肝癌细胞模型,做Piwil4基因敲除和过表达靶点选择、测序引物设计、质粒构建,转染至HepG2.2.15细胞,分为空白组(HepG2.2.15细胞未做任何处理)、敲除组(Piwil4基因敲除)、过表达组(Piwil4基因过表达)。测定细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及JNK/p38MAPK信号通路蛋白表达量。结果与空白组比较,过表达组Piwil4基因mRNA表达量升高,敲除组Piwil4基因mRNA表达量降低(P<0.05);与空白组比较,过表达组细胞增殖率升高,细胞凋亡率降低,敲除组细胞增殖率降低,细胞凋亡率升高,比较差异具有统计学意义(P<0.05);与空白组比较,过表达组细胞迁移、侵袭数升高,敲除组细胞迁移、侵袭数降低,比较差异具有统计学意义(P<0.05);与空白组比较,敲除组Caspase-3、Bax蛋白表达量升高,Survivin、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达量降低,JNK、p-JNK蛋白表达量升高,ERK、p-ERK、p38、p-p38蛋白表达量降低(P<0.05)。结论Piwil4基因敲除可抑制HBV感染所诱发的肝癌细胞增殖、迁移、侵袭,促进凋亡,发挥体外抗肿瘤作用,其机制可能与调控JNK/p38MAPK信号通路相关。

piwi基因在宫颈癌组织中的表达

目的本研究旨在探讨piwill、piwil3和piwil4在宫颈癌组织与宫颈正常组织中的差异性表达，为进一步确定其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。方法根据已知的3条基因序列设计合成3对特异性引物，利用RTPCR检测9对宫颈癌组织及癌旁正常组织的piwill、piwil3和piwil4 mRNA水平，并以β-actin基因为标准进行对比。结果宫颈癌组织piwill、piwil3和piwil4的表达水平明显高于正常组织。结论piwill、piwil3和piwil4在宫颈癌中的表达提示其可能参与了宫颈癌的发生发展过程。