Piwil4基因敲除对HBV感染诱发肝癌细胞模型的抑制作用及相关机制

目的分析Piwil4基因敲除抑制乙型肝炎病毒(HBV)感染诱发肝癌细胞模型的相关机制。方法选取HBV全长的稳定肝癌细胞系HepG2.2.15作为HBV感染所诱发的肝癌细胞模型,做Piwil4基因敲除和过表达靶点选择、测序引物设计、质粒构建,转染至HepG2.2.15细胞,分为空白组(HepG2.2.15细胞未做任何处理)、敲除组(Piwil4基因敲除)、过表达组(Piwil4基因过表达)。测定细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭及JNK/p38MAPK信号通路蛋白表达量。结果与空白组比较,过表达组Piwil4基因mRNA表达量升高,敲除组Piwil4基因mRNA表达量降低(P<0.05);与空白组比较,过表达组细胞增殖率升高,细胞凋亡率降低,敲除组细胞增殖率降低,细胞凋亡率升高,比较差异具有统计学意义(P<0.05);与空白组比较,过表达组细胞迁移、侵袭数升高,敲除组细胞迁移、侵袭数降低,比较差异具有统计学意义(P<0.05);与空白组比较,敲除组Caspase-3、Bax蛋白表达量升高,Survivin、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达量降低,JNK、p-JNK蛋白表达量升高,ERK、p-ERK、p38、p-p38蛋白表达量降低(P<0.05)。结论Piwil4基因敲除可抑制HBV感染所诱发的肝癌细胞增殖、迁移、侵袭,促进凋亡,发挥体外抗肿瘤作用,其机制可能与调控JNK/p38MAPK信号通路相关。

肝特异性Rbp4基因敲除小鼠的建立及糖代谢特征分析

目的 建立肝特异性Rbp4基因敲除小鼠模型,并初步探索肝特异性Rbp4基因缺失对糖代谢的影响。方法 利用Cre-LoxP技术,使用C57/BL6J小鼠和Alb-Cre小鼠构建肝特异性Rbp4基因敲除小鼠模型。利用PCR及琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型。选取10只18周龄C57/BL6J雄性小鼠为野生对照组(WT),10只同周龄flox纯合且Alb-Cre阴性小鼠为实验对照组(Rbp4~(flox/flox):Cre~-),10只同周龄flox纯合且Alb-Cre阳性小鼠为实验组(Rbp4~(flox/flox):Cre~+)。分别利用Western Blot及qRT-PCR验证小鼠肝中RBP4蛋白及Rbp4 mRNA表达水平。利用qRT-PCR检测其他组织中Rbp4 mRNA表达水平。采用苏木素-伊红(HE)染色观察肝组织形态。利用血糖仪检测小鼠尾静脉血液标本血糖值,进行葡萄糖耐量及胰岛素耐量实验。利用qRT-PCR检测肝糖代谢基因磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Pepck)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6pase)表达水平。结果 成功繁育并鉴定出肝特异性Rbp4基因敲除小鼠。Rbp4~(flox/flox):Cre~+组小鼠肝中RBP4蛋白表达显著减少(P<0.05),Rbp4 mRNA表达显著减少(P<0.05)。三组小鼠脂肪、肾、胰、脾、心脏和肌肉组织中Rbp4 mRNA的相对表达量差异无显著性(P>0.05)。HE染色、葡萄糖耐量及胰岛素耐量实验结果表明肝特异性Rbp4基因敲除对肝组织形态、葡萄糖耐量及胰岛素耐量无显著影响(P>0.05)。三组小鼠肝中Pepck mRNA表达差异具有显著性(P<0.05),两两比较显示,Rbp4~(flox/flox):Cre~+组小鼠肝中Pepck mRNA相对表达量较Rbp4~(flox/flox):Cre~-组小鼠降低(P<0.05)。三组小鼠肝中G6pase mRNA表达差异无显著性(P>0.05)。结论 成功构建了肝特异性Rbp4基因敲除小鼠模型,基因缺失可抑制小鼠肝Pepck mRNA表达,为进一步探索该基因在小鼠糖代谢中的作用提供依据。

Smad4基因敲除对小鼠听力和前庭功能的影响

目的研究Smad4基因敲除(Smad4+/-)小鼠听力和前庭功能的改变。方法检测Smad4基因敲除小鼠(1、2、3、6月龄)与同种同月龄的野生型(Smad4+/+)小鼠的ABR阈值。按Steal的方法测定小鼠的平衡功能,包括游泳试验、空间姿势反射,以及一般行为观察。结果2、3、6月龄Smad4+/-小鼠听力较同种野生型小鼠明显下降,两种基因型小鼠听阈有显著性差异(P<0.01),但1月龄的不同基因型小鼠听力水平无统计学差异(P>0.05)。Smad4基因敲除小鼠与野生型小鼠外观和体重无明显差异(P>0.05),生后至6月龄的Smad4+/-小鼠与野生型小鼠均无前庭功能异常和行为异常。结论单倍体Smad4基因敲除小鼠听力明显障碍,但前庭功能基本正常。表明Smad4对内耳的听觉有重要作用,可能存在着单倍体功能不全性;而单倍体Smad4基因缺失对于前庭功能影响可能不明显。

香蕉枯萎病菌内源报告基因Foc4carS的鉴定及其应用

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴转化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc)引起的香蕉毁灭性土传病害,其中4号生理小种(Foc4)能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。carS基因通过调控下游car结构基因参与调控镰刀菌类胡萝卜素的生物合成,本研究克隆鉴定了Foc4carS基因(FOIG_05085),Foc4carS蛋白具有典型的RING-finger蛋白结构域。利用分割标记法(Split-marker PCR)获得Foc4carS基因的融合片段,同时构建含有Foc4carS基因sgRNA591序列的pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4carS基因编辑载体,通过PEG介导的原生质体转化获得该基因的敲除突变体、回补突变体以及基因编辑敲除体,并对敲除和回补突变体的生物学特性和致病力进行分析。结果显示:ΔFoc4carS突变体的菌落直径、产孢量和致病力等生物学表型与野生菌株Foc4无显著差异,而ΔFoc4carS突变体菌落颜色呈深橙色,Foc4carS基因的缺失影响了次生代谢产物类胡萝卜素的生物合成;基因编辑的ΔFoc4carS(HDR)突变体不论是再生筛选板还是继代后的PDA平板,其菌落均出现典型的深橙色,表明Foc4carS可作为内源报告基因,在香蕉枯萎菌Foc4中进行基因质粒型CRISPR/Cas9编辑可行。

TLR4基因敲除小鼠对噪声性耳蜗损伤的反应

目的揭示Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)基因缺失对噪声性耳蜗感觉细胞损伤,听觉功能障碍和耳蜗免疫活力的影响作用,探讨噪声性耳蜗损伤的免疫炎性机制。方法将TLR4基因敲除(TLR4 KO)小鼠接触持续噪声暴露(1-7kHz,120dB SPL)1小时,以噪声暴露的野生型(WT)小鼠为对照,检测噪声暴露前和噪声暴露后25天四个频率短纯音(4 kHz、8 kHz、16 kHz和32 kHz)诱发的小鼠双耳ABR阈值。噪声暴露后1天,25天处死动物,解剖取双侧耳蜗。采用白细胞共同抗原(CD45)荧光免疫抗体标记噪声暴露前和噪声暴露后1天耳蜗基底膜免疫细胞,鬼笔环肽(phalloidin)染色噪声暴露前和噪声暴露后25天耳蜗基底膜毛细胞纤毛、表皮板的丝状肌动蛋白。荧光显微镜下观察噪声暴露后TLR4 KO小鼠和WT小鼠耳蜗基底膜组织的巨噬细胞、单核细胞和毛细胞形态变化,计数耳蜗基底膜外毛细胞的缺失数目。结果噪声暴露后1天,WT和TLR4 KO小鼠耳蜗基底膜均呈现单核细胞渗入。噪声暴露后25天,不同频率短纯音诱发的TLR4 KO小鼠ABR阈移和耳蜗基底膜外毛细胞缺失数目均低于WT小鼠(F=71.590, df=1,90, P<0.001;Tukey test, P<0.001),(F=8.996, df=1,17, P=0.008;Tukey test, P=0.008)。结论噪声暴露后TLR4基因缺失没有阻止单核细胞渗入耳蜗基底膜,但减轻噪声暴露后耳蜗感觉细胞和听功能损伤的程度。

Smad4条件基因敲除小鼠听功能初步研究

目的对Smad4条件基因敲除后三种不同基因型小鼠野生型+/+、杂合子+/-、纯合子-/-进行听功能检查,初步确定Smad4条件基因敲除后小鼠的听力学表型特征。方法对Smad4条件基因敲除后同窝出生的三种不同基因型小鼠野生型+/+、杂合子+/-、纯合子-/-分别进行听性脑干反应(ABR)和听神经复合动作电位(CAP)的检查,判断Smad4条件基因敲除后三种基因型小鼠是否有听力的改变;如果听力有所改变,再将两种方法相结合以综合判断听力改变可能的病理部位。结果各个月龄的Smad4条件基因敲除后的纯合子小鼠各频率的ABR阈值均在100dBSPL以上,有的甚至在最大给声刺激都无法引出可识别的波形。野生型和杂合子小鼠都可以诱发出可辨别、可重复的ABR波形。听神经动作电位的结果与脑干诱发电位结果相似,纯合型小鼠各个频率均未引出动作电位波形,另外两种基因型小鼠可以引出稳定的CAP波形。结论Smad4条件基因敲除后小鼠由于基因的缺陷而出现了重度感音神经性耳聋,纯合子小鼠出现全聋。

Smad4条件基因敲除小鼠前庭终器形态学研究

目的研究Smad4条件基因敲除小鼠前庭终器形态改变,探讨Smad4基因对于前庭发育的作用。方法利用建立的Smad4条件基因敲除小鼠模型,通过光镜观察Smad4(+/+)、Smad4(+/-)与Smad4(-/-)三种基因型小鼠(0.5、1.5月龄)的球囊及囊斑、椭圆囊及囊斑、半规管及壶腹嵴、前庭神经节、内淋巴管与囊的形态结构、毛细胞的形态及排列缺失情况。通过扫描电镜观察球囊斑、椭圆囊斑和壶腹嵴的形态结构、毛细胞及纤毛的排列缺失情况。结果Smad4(-/-)小鼠个体及内耳明显小于Smad4(+/+)和Smad4(+/-),而后面二者区别不大。所有小鼠的球囊及囊斑、椭圆囊及囊斑、半规管、前庭神经节、内淋巴管与囊的大小和结构正常,淋巴囊腔饱满,囊斑处的感觉上皮、耳石、毛细胞及纤毛排列整齐,没有发现明显的病变,三个基因型间没有差异。Smad4(-/-)小鼠壶腹嵴囊性变多且严重、后半规管壶腹嵴出现明显的副嵴、偶尔可见壶腹嵴感觉上皮空泡样变。壶腹嵴的毛细胞和支持细胞排列整齐,形态无明显改变,未见缺失。扫描电镜示球囊斑、椭圆囊斑、后、外、上半规管壶腹嵴正常,三个基因型之间没有差异。结论Smad4(-/-)小鼠的前庭终器有轻微病理改变,Smad4(+/+)与Smad4(+/-)小鼠的前庭终器形态结构基本正常,表明Smad4对于前庭终器的发育影响可能不明显。

SETD4基因敲除小鼠的构建及鉴定

目的构建并鉴定SETD4基因敲除小鼠,为研究SETD4的生物学功能提供动物模型。方法将引进的SETD4flox/+小鼠与EIIa-Cre小鼠进行杂交繁殖,得到基因型为SETD4+/-.EIIa-Cre的小鼠;再与C57BL/6小鼠杂交去除Cre酶,获得杂合子SETD4+/-小鼠;该小鼠自交获得纯合子SETD4-/-小鼠。通过PCR法鉴定子代小鼠的基因型;RT-PCR、荧光定量PCR方法鉴定纯合子的SETD4基因敲除小鼠SETD4m RNA表达情况;HE染色观察小鼠肝、肺组织的形态学变化。结果 PCR结果表明子代小鼠的基因型符合SETD4-/-;纯合子基因敲除小鼠SETD4 m RNA水平显著低于野生型小鼠;SETD4基因敲除小鼠肝、肺组织的形态学特征与野生型小鼠相比无明显差异。结论本研究基于Cre/loxp系统,成功构建并鉴定了SETD4基因敲除小鼠。

恒河猴piwil4基因的鉴定与表达分析

为了研究人类近亲恒河猴中PIWI家族蛋白PIWIL4的结构和表达情况,文章首次利用同源比对和RT-PCR方法克隆了恒河猴piwil4基因,检测了其mRNA在恒河猴心脏、脑、结肠、附睾和睾丸5种组织中的表达情况,利用生物信息学的方法对恒河猴piwil4基因和人的PIWIL4(HIWI2)基因编码的蛋白产物进行了同源性分析和结构域分析,并进一步利用免疫组化的方法比较了PIWIL4蛋白在成人、成年恒河猴和性未成熟恒河猴睾丸组织中的表达分布。结果表明,恒河猴piwil4 mRNA在多组织中表达,恒河猴和人的PIWIL4蛋白的氨基酸序列同源性达97%以上,均含有PAZ和Piwi结构域,它们在两物种成年个体睾丸组织中空间分布一致,但在不同发育阶段恒河猴睾丸组织中的分布发生了改变,幼猴中PIWIL4蛋白主要表达于生精小管细胞的细胞核,在成年猴睾丸组织中则表达于各种细胞的胞浆中。上述结果提示,piwil4基因在人类和恒河猴精子发生过程中作用类似,PIWIL4蛋白在幼猴和成年猴睾丸组织中的表达差异提示它们在不同发育阶段功能的改变。

载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块中血小板因子4和Toll样受体2的表达

目的观察高脂饲养的载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块表达Toll样受体2和血小板因子4的情况,探讨血小板因子4对内皮细胞Toll样受体2表达的影响。方法高脂饲料喂养载脂蛋白E基因敲除小鼠12周,建立动脉粥样硬化模型。安乐死处死动物,原位灌流固定,取主动脉于10%中性缓冲福尔马林中固定,石蜡包埋连续切片,HE染色观察动脉粥样硬化斑块形态,免疫组织化学检测斑块中Toll样受体2和血小板因子4的表达。结果载脂蛋白E基因敲除小鼠血脂水平明显增高,主动脉HE染色可见态动脉粥样硬化病变。在载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉富含脂质斑块中Toll样受体2表达上调,其中血管内皮细胞、巨噬细胞表达Toll样受体2明显增多。载脂蛋白E基因敲除小鼠主动脉斑块中也发现有血小板因子4表达,主要在内皮细胞和动脉粥样硬化斑块肩部。结论1.载脂蛋白E基因敲除小鼠粥样斑块中Toll样受体2表达上调,并且Toll样受体2主要表达在粥样斑块的内皮细胞和巨噬细胞上。2.载脂蛋白E基因敲除小鼠动脉粥样硬化斑块中可见血小板因子4表达。

敲除SLC39A5基因对4-NQO诱发C57BL/6小鼠食管癌模型建立的影响

目的探索敲除SLC39A5基因对4-NQO诱导的C57BL/6小鼠食管癌模型的影响。方法选取10只C57BL/6野生型小鼠作为阴性对照组,饮用浓度为100μg/ml的丙二醇空白溶液;选取140只野生型小鼠与80只SLC39A5基因敲除小鼠,采用饮水法摄入诱癌剂,即浓度为100μg/ml的4-NQO(4-nitroquinoline 1-oxide),实验时间为28周,实验结束后处死三组小鼠。结果阴性对照组小鼠、野生型小鼠和SLC39A5基因敲除小鼠在实验结束时其存活率分别为100%、92.96%、91.25%;三组小鼠食管癌诱癌成功率分别为0、61.36%、28.77%,两实验组小鼠诱癌成功率差异有统计学意义(χ2=19.98,P<0.001)。结论成功建立了C57BL/6小鼠及SLC39A5基因敲除小鼠的食管癌模型,同时验证了SLC39A5基因在食管癌发生发展中的促进作用。

CRISPR/Cas9系统敲除山羊TLR4基因载体构建及检测

TLR4是天然免疫系统中的一种重要模式识别受体,可选择性地识别病原微生物而启动天然免疫,在宿主天然免疫和获得性免疫中具有重要作用。山羊TLR4基因与多种疾病相关,然而,目前在山羊上关于TLR4基因敲除及相关功能的研究尚未见报道。采用CRISPR/cas9系统,首先设计TLR4基因的sgRNA片段,合成sgRNA核苷酸序列,构建同时表达sgRNA和Cas9 D10A的质粒PYSY-sgRNA,连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,最后对转化子进行验证,提取质粒并转染山羊成纤维细胞,通过测序进行敲除检测。结果表明:酶切和测序鉴定证明TLR4基因敲除载体构建正确。说明采用CRISPR/Cas9构建的载体,可为后续研究TLR4在支原体肺炎感染的免疫应答分子机制提供理论依据。

利用CRISPR/Cpf1系统构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的293T细胞株

【目的】基于CRISPR/Cpf1(AsCpf1/LbCpf1)技术构建人ABCG1和ABCG4基因敲除的人胚肾细胞(HEK293T)稳定细胞株,旨在研究ABCG1和ABCG4基因的生物学功能。【方法】针对ABCG1和ABCG4基因作用的功能域,设计2对靶向ABCG1和ABCG4基因前7个外显子的sgRNA序列,分别克隆到AsCpf1和LbCpf1的载体上。将测序验证正确的重组质粒转染到HEK293T细胞中,T7E1酶切和测序验证敲除效率,对敲除成功的293T细胞利用有限稀释法筛选获得基因双突变的敲除细胞株,对其基因组进行PCR扩增并双向测序验证编辑结果,选择有正确编辑结果的PCR产物进行TA克隆,进而测序验证单克隆细胞株编辑效率。【结果】结果获得敲除ABCG1和ABCG4基因的稳定细胞株各1株(AsCpf1-ABCG1-sgRNA 1-1和LbCpf1-ABCG4-sgRNA 2-1)。【结论】通过利用新型基因编辑技术CRISPR/Cpf1系统,获得了永久性敲除目的细胞靶基因的细胞株,可为进一步探索和证实ABCG1和ABCG4在细胞中胆固醇代谢和调节作用提供帮助。

中药护心康对TLR4基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型Wnt5a表达的影响

目的探讨TLR4基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型Wnt5a表达的变化及中药护心康的干预作用。方法SPF级TLR4基因敲除小鼠共68只,随机取10只为对照组,予以普通饲料喂养;其余58只予以高脂饲料建立动脉粥样硬化模型,喂养13周后从造模动物中随机选取5只解剖观察其胸主动脉,光镜下发现粥样斑块为造模成功。造模成功动物随机分为模型组、护心康组、阿托伐他汀组,Wnt抑制剂WIF组,每组12只,分别予以相应处理。正常组不做处理,模型组予以生理盐水灌胃并腹腔注射,其余各组均予相应药物灌胃和腹腔注射处理,灌胃容积均为0. 5 ml、腹腔注射容积均为0. 3 ml,每日1次。治疗8周后处死小鼠,心脏采血,酶比色法检测血脂;取胸主动脉,光镜下观察动脉粥样硬化形成情况;免疫组化法检测斑块中Wnt5a蛋白的表达。结果 (1)血脂检测:造模后动物胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平比正常组明显升高(P <0. 05);阿托伐他汀和护心康可以降低胆固醇和低密度脂蛋白水平(P<0. 05),WIF对二者的降低作用不明显;三种药物对甘油三酯和高密度脂蛋白的影响相对较小。(2)光镜观察:正常组无斑块形成,模型组可见内膜增厚,大量斑块明显形成,血管腔明显减小;各药物干预组斑块病变相对较轻。(3)Wnt5a蛋白表达:模型组中Wnt5a蛋白表达明显高于正常组(P <0. 01);与模型组相比,三种药物均能降低Wnt5a,Wnt抑制剂WIF降低作用较强(P <0. 01),护心康组和阿托伐他汀组也有明显的降低作用(P <0. 05); WIF降低Wnt5a的作用较阿托伐他汀强(P <0. 05)。结论 TLR4基因敲除小鼠动脉粥样硬化时Wnt5a表达明显升高,中药护心康能降低血脂和Wnt5a在动脉粥样硬化中的表达,从而可以减轻动脉粥样硬化的形成。

Rtn4-A/B基因敲除小鼠模型的制备

目的通过制备Rtn4-A/B基因敲除小鼠,探索Rtn4-B基因的生物学功能。方法用细菌人工染色体(BAC)载体构建Rtn4-A/B基因打靶载体并使其线性化,通过电转化法将其转入129SvEv品系雄性小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)。将正确同源重组的ES细胞注射入C57BL/6J小鼠囊胚腔,繁育出嵌合体小鼠后,进一步繁殖以获得杂合子小鼠。抽提小鼠尾尖组织DNA,采用PCR法鉴定小鼠的基因型。结果基因打靶后,得到14个发生双臂正确同源重组ES细胞克隆。利用阳性ES细胞克隆进行囊胚内显微注射,得到5只嵌合率大于50%的雄鼠,最终繁育得到4只Rtn4-A+/-B+/-杂合子小鼠。结论利用ES细胞基因打靶、同源重组等方法,成功获得Rtn4-A/B基因敲除杂合子小鼠。

LTC_4合酶基因敲除靶向载体的构建

目的:构建鼠LTC4合酶基因靶向敲除载体,用于转染鼠胚胎干细胞,建立LTC4合酶基因敲除鼠。方法:分离、克隆LTC4合酶基因的1.85kb和1.35kb片段,作为靶向载体的5'同源臂和3'同源臂,重组到pJNS2载体中,筛选鉴定阳性重组子。结果:构建的靶向载体由5'同源臂-Neo-3'同源臂-hTk-pJNS2构成。结论:经DNA测序及限制性酶切鉴定分析,该构建载体结构及序列正确,可用于转化鼠胚胎干细胞。

TGF-β1对皮肤组织特异性Smad4基因敲除小鼠组织培养影响的研究

目的应用组织块培养的方法，观察TGF-β1及其受体抑制剂SB-431542对皮肤组织特异性Smad4基因敲除小鼠与野生型小鼠表皮细胞增殖的影响。方法皮肤组织特异性Smad4基因敲除小鼠与野生型小鼠，制成背部烫伤模型。伤后5d取创面边缘皮肤组织，剪成1mm×2mm皮块，行组织块培养。实验分为6组，分别是：（1）Smad4基因敲除组（A组）；（2）Smad4基因敲除＋SB431542组（B组）；（3）杂合子组（C组）；（4）杂合子＋SB431542组（D组）；（5）野生型组（E组）；（6）野生型＋SB431542组（F组）。B、D、F组加入5×10^-4 MSB431542，作用1h。各组均加入5ng／ml TGF-β1，于37℃，5％C02条件下培养。于培养的第0、8、16、24、32、40、48小时，加入10μM BrdU标记液，标记1h。10％中性甲醛固定。病理切片，免疫组化染色，计算BrdU阳性率。结果TGF-β1可以降低杂合子和野生型小鼠表皮细胞PCNA阳性率和BrdU掺入率，TGF-β1作用于野生型小鼠16h，表皮细胞BrdU掺入率即有明显降低，但对基因敲除组小鼠无该作用，在皮肤组织块培养条件下，预先应用受体抑制剂SB431542作用1h，则TGF-β1的这种作用不再存在。结论TGF-β1对表皮细胞生长具有抑制作用，其受体拮抗剂SB-431542能拮抗这种抑制作用。

TLR4基因敲除对脓毒症小鼠急性肝损伤的影响

目的探究TLR4基因敲除对脂多糖(LPS)诱导的脓毒症小鼠急性肝损伤的影响。方法雄性C57小鼠和TLR4基因敲除鼠随机分为4组:WT组、WT-LPS组、TLR4-/-组、TLR4-/--LPS组。观察4组小鼠的一般生理特征,肝组织形态,肝组织Caspase3活性水平、蛋白氧化羰基含量以及肝组织中凋亡相关蛋白的表达水平。结果 WT-LPS组小鼠肝损伤表现明显;与WT-LPS组比较,TLR4-/--LPS组小鼠肝损伤减轻,Caspase3活性和氧化羰基水平下降,凋亡蛋白标志物表达下降(P <0.05)。结论 TLR4敲除可以减轻LPS诱导的脓毒症小鼠急性肝损伤,其机制可能是通过抑制凋亡通路的激活。

CRISPR/Cas9介导的猪Six1和Six4基因敲除细胞系的建立

目的:利用干细胞囊胚互补技术再生同种或异种动物器官已得到验证,其重要的前提是需要构建出相应的器官缺失动物模型。本文拟通过CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪Six1单基因和Six1/Six4双基因敲除猪细胞系,为构建肾脏发育缺陷和缺失猪模型奠定重要的研究基础。方法:选取猪Six1基因和Six4基因第一外显子为敲除靶点,分别设计并合成单导向RNA(single guide RNA,sg RNA),将其插入含有Cas9骨架的PX330质粒,分别构建Six1基因和Six4基因敲除打靶载体PX330-sg RNA1和PX330-sg RNA4;用T7EN1酶验证打靶载体敲除效率后,将高效打靶载体与含G418抗性的质粒(p CMV-td Tomato)共转染原代猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)中,并通过药物筛选获得单克隆细胞群落,随后对单克隆细胞进行基因型鉴定。结果:分别成功构建Six1和Six4基因的Cas9/sg RNA表达载体。转染Six1基因打靶载体经药物筛选后,利用PCR方法鉴定所获得的Six1基因敲除单克隆细胞系48个,其中Six1-/-细胞系21个。通过同样方法同时转染Six1基因和Six4基因打靶载体,经药物筛选后共获得44个单克隆细胞系,其中Six1-/-Six4-/-细胞系为13个。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术可高效获得Six1单基因敲除细胞系和Six1/Six4双基因敲除细胞系,为构建肾脏发育缺陷猪动物模型提供了基础,并有助于研究Six1和Six4基因在猪肾脏发育中的功能。

髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠的构建与鉴定

目的利用FLP/FRT、Cre/Loxp重组酶系统构建并鉴定髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠,为深入研究SETD4的生物学功能奠定基础。方法将引进的Setd4^(flox/+)小鼠自交,筛选出子代基因型为Setd4^(flox/flox)的小鼠;与FLP小鼠交配,得到Setd4^(fl/+/flp)小鼠;然后分别与C57BL/6小鼠交配去除FLP酶,筛选出Setd4^(fl/+)小鼠;与Lyz2-Cre小鼠交配,筛选出Setd4^(fl/+)/Lyz2-Cre小鼠;将得到的Setd^(4fl/+)和Setd4^(fl/+)/Lyz2-Cre小鼠交配,筛选出Setd4^(-/-)/Lyz2-Cre小鼠,即髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠。利用PCR技术鉴定小鼠基因型;实时荧光定量PCR技术检测小鼠腹腔巨噬细胞及肝组织中SETD4的mRNA表达水平验证敲除情况。结果髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠腹腔巨噬细胞中SETD4 mRNA水平较野生型小鼠显著降低;而在肝组织中无显著差异。结论利用FLP/FRT、Cre/Loxp系统成功构建髓样细胞特异性SETD4基因敲除小鼠,为后续的功能学研究提供了动物模型。