pL启动子控制的人白细胞介素4表达

利用高效表达载体及人工合成的寡核苷酸接头,构建了一个新的人rIL-4表达克隆pBMhIL4,在pL启动子的控制下,于大肠杆菌中表达完整的人rIL-4蛋白分子。表达产物以包涵体形式存在于大肠杆菌胞浆,SDS-PAGE分析表明表达的人rIL-4约占总菌体蛋白的5～10%,分子量约为15KD。抽提复性后具有较高的生物学活性,以其TCGF样活性检测每升菌液含人IL-4 1×10~6 U,改良的3.5 M盐酸胍加0.25%Triton X100裂解包涵体法具有更高的回收率和生物学活性。

诱导方式对P_L启动子控制下人工合成心钠素28肽基因转录动态变化的影响

本文用含有人工合成28肽心钠素基因质粒的大肠杆菌(TAP106-pYX40),分别进行温度诱导和丝裂霉素C诱导,提取菌体中的总RNA,与γ-^(32)P标记的心钠素基因片段进行RNA打点杂交,并通过测定杂交阳性信号的总灰度值(Totalgray value),建立了人心钠素基因特异mRNA相对定量方法,从而观察到温度诱导对P_L启动子控制下的心钠素基团转录发生得慢,特异的mRAN产量较低,但转录所持续的时间长,而丝裂霉素C诱导对P_L启动子控制下的心钠素基因转录发生得快,特异mRNA产量高,但持续的时间短。

大肠杆菌UDP-葡萄糖脱氢酶基因的克隆、表达及酶活性测定

UDP-葡萄糖脱氢酶(UDP-GlcDH)是透明质酸合成过程中关键的限速酶,可以将UDP-葡萄糖催化生成透明质酸必需的前体物质UDP-葡萄糖醛酸。分别采用大肠杆菌BL21(DE3)和YK537的基因组DNA为模板,通过PCR获得BL21(DE3)和YK537的UDP-GlcDH基因ugd,并采用分子生物学方法分别将两种菌株的ugd基因插入含有PL启动子的pBLMVL2载体中,分别获得重组质粒pBLBugd和pBLYugd,再分别转化于大肠杆菌BL21(DE3)和YK537中,获得4株重组菌;采用升温诱导表达UDP-GlcDH,并测定不同重组菌株的UDP-GlcDH的活性,探索出不同温度诱导条件下UDP-GlcDH的表达量及活性差异。结果表明,采用双阶段升温诱导方式并添加适量酵母粉可以显著提高重组菌表达UDP-GlcDH的活性。

p300和HDAC3介导的可逆的乙酰化作用参与调控IL-18p1启动子荧光素酶报告基因活性

IL-18是调节先天性免疫和获得性免疫的重要细胞因子,在Th1的发育中起着重要作用.p300是一种具有组蛋白乙酰化酶活性的转录辅因子.HDAC3是一种组蛋白去乙酰化酶.通过一系列共转染实验证实,p300能够刺激外源IL-18启动子活性,而HDAC3则抑制其活性.p300的乙酰化酶活性对于增强IL-18p1启动子荧光素酶报告基因激活是必需的.p300能提高转录因子c-Fos介导的IL-18启动子荧光素酶报告基因的活性,这种作用能被HDAC3抑制.p300对于内源IL-18mRNA合成有增强作用.首次证实了组蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶参与IL-18p1启动子活性的调控,为进一步研究IL-18基因表达调控的机制奠定基础.

重组大肠杆菌BL21(pBAI)生产人干扰素α2b

通过培养重组大肠杆菌BL21(pBAI)表达人干扰素α2b(Human Interferonα2b,hIFNα2b)。hIFNα2b表达由PL启动子控制,通过升温至42°C诱导表达。本研究比较了分批培养和多种补料分批培养方式下hIFNα2b的生产,其中通过恒速流加葡萄糖,hIFNα2b的表达量达到6 540 mg/L,平均生产速率和比速率分别为546 mg/(L.h)和27 mg/(g.h)。升温前1.5 h补充25 g酵母提取物,并以0.27 g/(g.h)的比速率供应葡萄糖,hIFNα2b的平均生产速率达到1 006 mg/(L.h),比生产速率为54 mg/(g.h),对有机氮源的得率提高到138 mg/g。

葡萄糖供应速率对大肠杆菌表达及分泌人表皮生长因子的影响

采用一株大肠杆菌BL 21(DE 3)[pBLMVL 2EGF]生产人表皮生长因子(hEGF),其中hEGF表达由PL启动子控制并通过phoA信号肽分泌到胞外。实验结果表明:诱导阶段以恒定比供应速率流加葡萄糖时,流加速率对hEGF的表达和分泌有很大影响。当葡萄糖比供应速率为0.122g/(g.h)时,hEGF表达水平最低,分泌效率最差,只有37.5%;随着葡萄糖比供应速率的增加,胞外和胞内hEGF比生产速率明显增加,当葡萄糖比供应速率为0.196 g/(g.h)时,单位菌体产生的hEGF水平最高(121.6 m g/g),其中分泌至胞外的hEGF占42%。此外,诱导前补充有机氮源有利于提高诱导初始hEGF的生产速率。