水稻泛素连接酶D3与抗病相关蛋白VOZ2的互作分析

多蘖矮秆基因dwarf-3(D3)是水稻独脚金内酯信号转导过程中的重要节点基因,拟南芥中的MAX2基因与D3同源,且MAX2参与拟南芥的抗病防卫反应。本研究以水稻泛素连接酶D3为诱饵进行酵母双杂筛库,发现水稻抗病相关蛋白维管植物单锌指蛋白VOZ2与D3存在潜在的相互作用。通过酵母双杂交试验证实,D3与VOZ2存在互作。通过荧光定量PCR证实,接种水稻白叶枯病菌后,VOZ2基因在转录水平上的表达受到显著诱导。利用水稻原生质体开展的亚细胞共定位实验发现,D3与VOZ2共定位于细胞核。双分子荧光互补实验发现,D3与VOZ2在烟草叶肉细胞的细胞核和细胞质均产生较强的荧光,进一步证实了D3与VOZ2的相互作用。研究结果为进一步探究D3和VOZ2在水稻抗病防卫反应中的功能与分子机理奠定了基础。

逆境相关植物锌指蛋白的研究进展

锌是植物必需的营养元素,锌指蛋白因其具有指状结构特征且能结合Zn2+而得名,植物锌指蛋白包含特有的QALGGH保守结构,可能涉及调控植物特有的生物学功能。人们已经从拟南芥(Arabidopsis thaliana)、矮牵牛(Petunia hybrida Vilm)、水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)、棉花(Gossypium hirsutum)等植物中克隆了许多编码锌指蛋白的基因,并对其结构及功能进行了研究。利用转基因技术,将一些与逆境胁迫相关的锌指蛋白基因在目标植物中过量表达后,能对植物起到增强抗逆性的作用,说明锌指蛋白在增强植物逆境抗性方面有着广阔的应用前景。

植物锌指蛋白的功能研究进展

综述植物锌指蛋白的功能,为日后利用基因工程技术改良作物品质、提高作物的抗逆性提供参考。

植物TFⅢA类型锌指蛋白的研究进展

锌指蛋白作为一种转录调控因子,在植物的生长发育中起着重要作用.近年来,在克隆植物锌指蛋白基因方面取得了很大进展,特别是对于植物TFⅢA类型锌指蛋白的研究.目前已经获得了近30个TFⅢA类型锌指蛋白的基因克隆.已发现的TFⅢA锌指蛋白参与了一些重要过程的调控,如:形态建成、雄配子产生、胚的发育、胁迫反应等.

大豆C_2H_2型锌指蛋白基因SCTF-1转化及功能分析

为探讨锌指蛋白在大豆对非生物逆境胁迫耐受过程中的作用,构建了锌指蛋白基因SCTF-1的植物表达载体p CPB-SCTF-1,利用花粉管通道法将其导入大豆中,通过抗性筛选及PCR检测,共获得了6株转SCTF-1基因植株,Southern杂交鉴定表明功能元件以单拷贝形式整合于受体基因组中。荧光定量PCR检测证明转化植株在根、茎、叶部位的表达与未转化植株相比显著提高。在4℃低温胁迫下,转SCTF-1基因植株相对电导率明显低于非转化植株,降低了21.10%～23.09%;丙二醛含量明显低于非转化植株,降低了10.56%～11.74%;过氧化物酶活性明显高于非转化植株,增加了25.02%～30.38%;转基因植株叶片未呈现明显的萎缩、萎蔫、打卷现象。因此,转SCTF-1基因的过量表达提高了转基因大豆的耐冷能力。

甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草

根据本实验室克隆的甘蔗锌指蛋白ShZP基因cDNA序列,在开放阅读框两侧设计特异引物,通过PCR扩增引入相应的酶切位点,把甘蔗ShZP基因的编码区(大小为725bp)cDNA片段,分别以正向和反向插入到中间载体pCRBI的Prd29A启动子和NOS终止子之间,构建了其正义植物表达载体pCRBIShZP和反义表达载体pCRBIantiShZP。采用冻融法分别将pCRBIShZP和pCRBIantiShZP导入根瘤农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导法对烟草进行转化,经过12mg/L的PPT连续抗性筛选,共获得23株抗性植株,对其中的5株转正义基因烟草植株和9株转反义基因烟草植株进行PCR检测,分别获得3株转正义基因的阳性植株和4株转反义基因的阳性植株。PCR检测结果初步证明外源甘蔗锌指蛋白ShZP基因已成功整合到烟草基因组中,这一研究为植物抗逆基因工程研究打下了一定的基础。

绒毛白蜡FvSAP1基因的克隆与分析及表达载体的构建

以绒毛白蜡幼苗为试材,Illumina HiSeq 2000高通量测序技术获得的绒毛白蜡转录组Unigene数据为基础,采用RT-PCR方法克隆绒毛白蜡A20/AN1型锌指蛋白基因FvSAP1编码区序列,并通过双酶切等技术构建pCAMBIA2300-FvSAP1植物表达载体。结果表明,从绒毛白蜡中成功克隆出1个A20/AN1型锌指蛋白基因FvSAP1的编码区序列,且成功构建了pCAMBIA2300-FvSAP1植物表达载体。基因编码区长度为846bp,可编码281个氨基酸,分子量为31.0kDa,等电点为8.34,原子总数为4269个,分子式为C1332H2106N400O407S24。蛋白质序列分析表明,FvSAP1具有两个AN1锌指结构,其序列模式为C-X4-C-X(9-12)-C-X(1-2)-C-X4-C-X2-H-X5-H-X-C。Blast分析表明FvSAP1与芝麻(Sesamum indicum,XP_011075237.1)SiSAP16序列的相似性最高,序列一致性为78%。将FvSAP1与同类型的锌指蛋白进行多重序列比较,结果显示该类蛋白序列在不同物种之间具有较高的保守性。

水稻锌指蛋白基因CRISPR/Cas9突变体的构建及突变分析

【目的】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻锌指蛋白基因(OsC3H54)进行基因编辑,筛选鉴定出其突变体植株,为深入研究OsC3H54的生物学功能提供良好材料,也为水稻锌指蛋白研究提供参考依据。【方法】通过E-CRISP在Os C3H54基因的外显子上设计靶点序列,将靶点序列连接至OsU6SK载体上,再与Cas9一起连接到pCAMBIA1300双元载体上,获得CRISPR/Cas9重组双元载体,通过农杆菌介导将其转入日本晴水稻愈伤组织,利用潮霉素进行抗性筛选,获得突变体植株,并分析其靶点位置的碱基及编码氨基酸突变情况。【结果】在OsC3H54基因第2个外显子上找到2个符合靶点设计要求的靶点,分别为TG1:5'-CCGCCGCGGCTGCCTTTGGATAC-3'和TG2:5'-CCTTCCC CAATGGCGGGGGTGGC-3'。将OsU6SK载体和靶点序列正确连接的重组载体与Cas9一起连接至pCAMBIA1300双载体上,成功获得CRISPR/Cas9重组双元载体(pCAMBIA1300-Cas9-TG1和pCAMBIA1300-Cas9-TG2)。通过农杆菌介导转入日本晴水稻,经潮霉素抗性筛选获得TG1靶点株系和TG2靶点株系,共16株CRISPR/Cas9突变体植株。CRISPR/Cas9突变体植株在靶点序列的突变位点位置附近出现套峰,表明2个株系的植株均发生碱基突变,其中Y1、Y2、Y3和Y4突变体植株均为单碱基插入突变,最终导致编码的氨基酸发生移码突变,蛋白翻译提前终止。【结论】水稻OsC3H54基因CRISPR/Cas9突变体植株的获得为进一步研究水稻锌指蛋白生物学功能提供了良好材料。

植物C_2H_2型锌指蛋白研究进展

C_2H_2型锌指蛋白是锌指家族中最经典也是目前研究最为深入的一类锌指蛋白。植物中该类锌指蛋白大多具有高度保守的基序QALGGH,并且该序列除了Q其他任何一个氨基酸的突变都会导致该蛋白完全失去结合DNA的功能,而Q突变则会大大降低结合DNA的能力。本综述综述了C_2H_2型锌指蛋白的结构特征、分类方法以及近年来的功能研究成果,系统介绍了植物中该类蛋白在生长发育、非生物胁迫如干旱胁迫、盐胁迫以及冷胁迫等方面的作用,为今后C_2H_2型锌指蛋白功能研究的深入奠定基础。

茶树CsBBX基因家族的鉴定与表达

锌指蛋白是一类含有“手指状”结构域的蛋白质,其中B-BOX(BBX)蛋白在植物的生长发育及逆境胁迫响应中具有重要的作用.利用生物信息学方法,从茶树基因组中鉴定出31个CsBBX基因,全面分析其生物信息学特征,同时分析它们在干旱、盐胁迫和MeJA处理中的转录组数据.结果显示,CsBBX基因大小差异较大,开放阅读框在324-1746 bp之间,编码氨基酸长在107-581 aa之间.CsBBX的编码蛋白序列中含有保守的BOX1(B1)、BOX2(B2)和CCT结构域,可以分为B1B2+CCT(Ⅰ和Ⅱ)、B1+CCT(Ⅲ)、B1+B2(Ⅳ)和B1(Ⅴ)等5种类型.启动子顺式作用元件预测显示,CsBBX基因启动子中含有多种光响应元件,同时还富含多种与植物生长发育及逆境胁迫响应相关的顺式作用元件.CsBBX基因在叶片组织中具有较高的表达水平,且部分基因随着叶片成熟度的增加转录水平升高.干旱和盐胁迫条件下,大部分CsBBX基因的表达受抑制,而部分基因被诱导表达;大部分CsBBX基因的表达受MeJA诱导.因此推测CsBBX基因在茶树生长发育及抗逆响应中发挥了重要的功能.