三种大肠杆菌高效感受态的制备及转化

描述了一种改良的高效细菌感受态的制备和感受态细胞的保藏及细菌的转化方法.三种不同的大肠杆菌分别是DH5α,TG1和XL1blue,其中最有效的是XL1blue.每种菌株的感受态细胞制备的最佳光密度(OD600值)不同.对感受态细胞的存储时间及其与转化效率之间的关系也进行了研究,结果显示感受态细胞可以在-20℃存储7d,在-70℃存储15d.将常见的方法做了三种改进:首先是将CaCl2溶液改为TB溶液;其次是将培养基由LB换成S.O.C;再就是在质粒对感受态细胞的转化过程中加入DMSO或PEG8000.改良的细菌转化系统比常见的方法能提高转化效率约1000倍,是一种高效的细菌转化系统.

转化条件对质粒DNA转化大肠杆菌的影响

研究了质粒DNA大小、质粒DNA浓度、CaCl2 浓度、热休克时间及感受态细胞保藏时间等因素对大肠杆菌HB1 0 1和JM1 0 5转化频率的影响 ,并对转化子中质粒DNA进行了分离、酶切、琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明 ,CaCl2 浓度、质粒大小和浓度 ,以及感受态细胞的活力对转化频率有重要影响 ,42℃热休克处理可以提高转化频率。

影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨

目的探讨影响大肠杆菌DH5a电转化效率的几个关键但易被忽略的因素。方法于室温(25℃)用空气浴振荡和水浴振荡培养大肠杆菌DH5a,用10%(V/V)甘油-水溶液和10%(V/V)甘油-生理盐水溶液冻存所制感受态细胞。在电压2.5kV、电阻200Ω、电容25μF的条件下进行电转化,电击冰浴(0～10min)后测定转化效率。结果于25℃水浴振荡培养细菌、10%甘油-生理盐水溶液冻存感受态细胞、电转化后冰浴6min,转化效率高达1.01×1010CFU/μg DNA。结论该法适合于大肠杆菌DH5a,可获得较高的转化效率。

低温培养对大肠杆菌电穿孔转化效率的影响

在18℃和37℃振荡培养大肠杆菌DH5α并制备感受态细胞,用Eppendorf公司的Multiporator电转移仪进行电穿孔转化,研究了培养温度对转化效率的影响.实验结果表明,低温(18℃)培养的细菌,回收时的OD600值在0.5～1.0时,转化效率都维持在高水平;而在37℃培养的细菌,转化效率仅在OD600 0.6～0.7时出现一个锐利的峰值,此OD600值前后转化效率显著下降.在不影响细胞生长的情况下,18℃培养细菌的转化效率随电场强度增加而升高;而37℃培养的细菌在电场强度超过20.5 kV/cm时转化效率将大幅度下降.另外,还对影响转化效率的其他因素(培养基、振荡培养时的转速、细胞密度、质粒浓度、电击前后冰浴时间等)进行了优化,建立了一个便利而高效的质粒DNA电转化方法,获得1.02×1010cfu/μg DNA的高转化效率.

一种用质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞的实用操作技巧

目的是建立一种简化、实用的用质粒DNA转化大肠杆菌的操作方法。采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。以质粒pUC18,pCSN44,pAN52-1Not,pETts,pANth和植物双元表达载体pCAMBIA1301分别转化用于质粒扩增与保存的常用大肠杆菌菌株Top10和DH5α以及用于原核表达的常用大肠杆菌菌株BL21(DE3)和TB1。质粒与感受态细胞的混合液置冰上作用一定时间后,直接涂布含有筛选抗生素的LB平板,于37℃培养12～16h。结果表明,用不同大小的质粒DNA转化不同的大肠杆菌菌株,都可以获得满足实验要求,转化效率可高达103～4阳性克隆/μg。该方法较标准的转化流程更加简便、省时、实用。

表达KstD重组大肠杆菌转化甾体化合物的条件优化

3-甾酮-Δ1脱氢酶是胆固醇降解的关键酶之一,能脱去甾酮C1,2位上的氢原子,形成双键,在甾体药物的合成过程中具有重要的作用.以异源表达3-甾酮-Δ1脱氢酶的重组大肠杆菌为材料,对其培养条件以及黄体酮转化条件进行了优化,实现了甾体化合物的高效转化.首先,对表达3-甾酮-Δ1脱氢酶基因的重组大肠杆菌的培养条件对黄体酮脱氢的影响进行了研究,结果表明,IPTG浓度为0.05mmol/L,在28℃,pH值为7的条件下诱导培养5h,获得最高转化活性的细胞;其次,以优化条件下获得的菌体为催化剂,研究了各种转化条件对底物转化的影响,结果表明,以甲基-β-环糊精为助溶剂,转化温度为37℃,底物质量浓度为6g/L,菌体量为100g/L,pH为7.0,黄体酮的转化率达到99%以上,比优化前的产量提高了2倍,转化率提高近1倍.

大肠杆菌DH5α感受态细胞转化率的改进

针对实验材料E.coli DH5α,对该菌株在不同生长时期的转化效率进行测定,确立了一个能制备高转化率感受态细胞的实验方案.结果表明:在细菌的生长繁殖过程中,其转化率有很大变化;得到了E.coli DH5α菌株制备感受态细胞的最佳条件.

大肠杆菌耐药质粒传播性的分析

目的对大肠杆菌中含有的耐药质粒的传播性进行分析。方法对临床分离的12例耐三代头孢酶素的大肠杆菌质粒提取,并进行转化,对转化株及标准株进行药敏比较实验。结果对临床分离的12株耐三代头孢酶素的大肠杆菌进行质粒提取,其中2株提取到了相同的质粒,将提取的质粒做转化实验后做药敏对照实验,发现转化后的细菌对大部分的抗生素耐药。结论大肠杆菌中的耐药质粒具有传播的可能性。

一种简易、廉价、高效构建重组腺病毒载体的方法

目的:建立构建重组腺病毒载体的简易、廉价、高效方法,为进一步应用含自杀基因的重组腺病毒治疗恶性肿瘤奠定基础。方法:PmeⅠ线性化腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV、切胶纯化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1按一定比例混合后,以化学转化法导入大肠杆菌BJ5183,在菌内进行同源重组,构建重组腺病毒质粒rpAdEasyGFP。以脂质体法将重组质粒转染293细胞包装重组腺病毒rAdGFP。结果:细菌内同源重组率高达80%;在293细胞中成功产生重组腺病毒。结论:对目前应用广泛的AdEasy系统进行了有效改进,在获得较高阳性重组率的同时,降低了对实验室设备的要求。

一种高效、快速的大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化方法

目的:建立一种高效、快速的大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化的方法。方法:质粒DNA加入感受态细胞,经短暂冰浴和热休克后,直接涂布预热至37℃的平板。以大肠杆菌DH5α为受体菌,研究CaCl2溶液浓度、感受态细胞的存放时间、转化时间及转化后的培养时间等对质粒转化效率的影响。结果:以100 mmol/L CaCl2溶液制备感受态细胞,冰浴转化5 min,经42℃热休克作用90 s后直接涂平板筛选转化子,获得与常规转化方法相当的转化效率。CaCl2溶液浓度和感受态细胞的存放时间对转化效率有明显的影响,而转化时间和转化后的振荡培养时间对转化效率的影响不明显。结论:成功地建立了一种高效、快速的感受态细胞制备及质粒转化的方法。

跨境电商背景下白酒企业转型升级分析与对策

为克服行业所面临的发展性问题,对跨境电商背景下的白酒企业转型升级对策展开分析。在研究白酒企业跨境电商转型外在、内在压力现状的基础上,结合已具备的条件因素,确定跨境电商背景下白酒企业转型的动因及条件。再从宏观影响、内部影响两个角度入手,定位白酒类企业的经营战略现状。结合现有经济现状,分析企业转型路径、管理机制及战略经营手段,完成白酒类企业的转型升级对策研究。

大肠杆菌DH12S菌株高效电击转化条件的探讨(英文)

探讨了电击转化法介导质粒DNA转化到大肠杆菌DH12S的最佳条件,以提高其转化效率.将pUC19质粒转化大肠杆菌DH12S菌株,观察不同的电击转化条件对转化效率的影响.结果表明,电击缓冲液的离子强度、细菌生长状态、感受态细胞保存时间及质粒DNA浓度对转化效率均有不同程度的影响;在电压2.5 kV,电阻200Ω,电容25μF,脉冲时间4.3ms和低离子强度电击缓冲液的条件下能获得较高的电击转化率,证明该优化电击转化条件能提高转化效率.

苯基乳酸耐受性大肠杆菌的筛选及其高产苯基乳酸特性

苯基乳酸(phenyllactic acid,PLA)耐受性菌株的筛选能够有效降低PLA对生产菌株的抑制作用,有利于PLA产量的提高。通过紫外诱变的方法筛选耐受PLA的菌株,并应用于PLA的合成。以Escherichia coli BL21(DE3)作为原始出发菌株,通过紫外诱变的方法诱变筛选获得一株耐受PLA突变菌株E.coli Z2016(CCTCC保藏编号M2016332)。以E.coli Z2016为宿主菌,分别构建了重组菌株E.coli Z2016 pET-28a-ldh^(Y52V)和E.coli Z2016 pET-28a-ldhL用于D-和L-苯基乳酸的合成。结果表明:E.coli Z2016在含有1 g/L D-PLA的培养基中能够正常生长;重组突变菌株E.coli Z2016 pET-28a-ldh^(Y52V)和E.coli Z2016 pET-28a-ldhL全细胞合成D-PLA和L-PLA产量分别为6.75、6.97 g/(L·h),较重组出发菌株分别提高了14.02%和8.95%;分批补加底物反应120 min,E.coli Z2016 pET-28aldh^(Y52V)得到的D-PLA为20.02 g/L,较对照组提高22.17%,转化率为90.07%;E.coli Z2016 pET-28a-ldhL得到的L-PLA产量为20.87 g/L,较对照组提高16.85%,最终转化率为91.24%。筛选耐受性菌株是提高PLA产量的有效途径。

不同培养时期的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌间发生的跨属自然遗传转化

携带穿梭质粒的大肠杆菌与作为受体的枯草芽孢杆菌分别培养至不同生长阶段混合均匀后静置40min,涂布选择性平板,37℃培养30h后得到一定数目的转化子,DNaseⅠ敏感实验证实质粒是通过自然遗传转化而非其它形式发生转移。实验发现大肠杆菌可以在特定生长时期向胞外分泌DNA,并且在对数期具有最高的提供质粒的能力,而生长后期的细胞因为体系中DNase量的增加转化频率下降。进一步的研究发现枯草芽孢杆菌在营养丰富的LB培养基中也具有与基本培养基中相当的转化能力,并且在对数生长前期具有较高的转化频率。

提高重组质粒转化E. coli DH5α方法的研究

研究了质粒载体和外源DNA的浓度、酶切体系的酶切时间以及酶切产物的链接时间对转化效率的影响。结果表明,当pUC19质粒载体的浓度为25ng/μL,外源基因λDNA的浓度为100ng/μL,酶切时间3h,且连接时间为14h时,构建出的重组质粒转化大肠杆菌DH5α效率最高。

抗汞菌株的分离鉴定及特性

从污染物中分离到一株细菌 ＫＨ４，经鉴定为假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）。该菌可在４０ μｇ／ｍＬ的ＨｇＣｌ２中生长，当ＨｇＣｌ２浓度为３０ μｇ／ｍＬ时，２４ ｈ去汞率为９１．７％。该菌的最适生长温度为３０℃，ｐＨ为７。该菌经质粒检测和转化实验结果表明具有一抗汞质粒，且可通过转化转移。

The expression and antigenicity identification of recombinant rat TGF-β1 in bacteria

In order to study structure-function details of TGF-β1, the recombinant mature form of rat TGF-β1 was expressed in bacteria. Synthesis of the 112 amino-acid carboxyl-terminal part of TGF-β1 (amino acid 279-390) was controlled by an inducible gene expression system based on bacteriophage T7 RNA polymerase. This system allowed an active and selective synthesis of recombinant TGF-β1. The molecular weight of expressed TGF-β1 monomer determined on SDS-polyacrylamide gel under reducing conditions was about 13 kD. Serial detergent washes combined with a single gel-filtration purification step were sufficient to purify the expression product to homogeneity. Amino-terminal sequencing revealed that the N-terminal of the recombinant protein was identical to the published data. In Western blot analysis the recombinant polypeptide showed excellent antigenicity against polyclonal TGF-β1 antibody. The mature recombinant rat TGF-β1 expressed in this study provides a useful tool for future detailed structural and functional studies.

细菌自然转化的分子机制研究进展

自然环境中,具备自然转化能力的细菌可以自发地从外界获取DNA,从而获得新的遗传性状。为能够自然地被转化,细菌需首先建立一个被称作感受态的生理状态并在此状态下表达DNA摄取和加工相关的基因。DNA摄取基因的表达产物可组装一个能将外源DNA摄入细胞质的蛋白复合物。在细胞质中,进入的DNA可同基因组DNA发生同源重组或建立成一个独立的质粒。一般DNA摄入细胞的过程可分为两个阶段,即从外部基质到细胞周质和跨细胞内膜的转运。近年来,包括作者在内的研究人员发现大肠杆菌中存在新的自然质粒转化模式。本文将首先综述近年来细菌自然转化的分子机制,随后简要介绍大肠杆菌中独特的自然质粒转化模式。

高转化效率甲基化酶缺陷大肠杆菌感受态细胞制备条件的优化

目的优化高转化效率甲基化酶缺陷的大肠杆菌DM1感受态细胞的制备条件。方法采用不同生长状态、转化冰浴时间、热激时间及转化后复苏时间的大肠杆菌DM1制备感受态细胞,分析转化效率。结果 A600值为0.39和0.69的菌液制备感受态细胞,转化冰浴时间为30min,42℃热激处理90s,大肠杆菌DM1的转化效率最高;转化后复苏时间对细菌转化效率的影响不明显。结论已优化了高转化效率甲基化酶缺陷的大肠杆菌DM1感受态细胞的制备条件,可满足大部分在质粒中进行的常规克隆的需要。

大熊猫肠道抗生素耐药菌质粒的研究

对分离自四川省卧龙保护区大熊猫肠道的6株大肠杆菌的抗生素抗性与质粒的关系进行了研究,结果显示:6株大肠杆菌中都存在不同大小的质粒DNA;采用SDS-高温法处理每株大肠杆菌后,有2类质粒在琼脂糖凝胶上的条带数减少,菌株的抗生素抗性水平也有所降低,有2株菌的某些抗生素抗性完全消失;将分离自6株大肠杆菌的质粒转化大肠杆菌JM109,获得1个氨苄青霉素抗性转化子.这些结果表明,大熊猫肠道中的大肠杆菌的抗生素抗性与它们含有的质粒有关.