Construction of a vaccinia virus vectored multi--epitope live vaccine candidate for Plasmodium falciparum

To construct live recombinant vaccinia virus, The HGFSP gene encoding CSP, MSA1, MSA2, RESA,IL-1 and TT epitopes was inserted into the Eec RI and Burn HI sites of pSK plasmid. After digested with Eco RI,bluntly ended by Klenow enzyme and digested with Sac I, the HGFSP gene was cloned into the Sma I and Sac I sites of the vaccinia virus insertion vector (pJ2--16). Recombinant plasmids were identified by gel electrophoresis,restriction enzyme and enzyme map. Results evidenced that HGFSP gene fragment was correctly inserted into the cloning site of hemagglutinin (HA) gene of the pJ2--16 vector. The recombinant plasmids were trans feeted into Cos--7 cells, which were infected with wild type of vaccinia virus Tiantan strain, by means of lipofectamine. Two recombinant vaccinia viruses (HA) were screened and cloned by chicken hemadorption test in BHK21 cells. Indirect immunofluorescence assay (IFA), Dot--ELISA and Western blot with the antibodies against HGFSP protein expressed by E. colt showed that one of the 2 recombinant vaccinia virus expressed desired proteins in infected BHK21 cells. Western blot also showed that the molecular weight of 2 of expressed protein bands was about 23 kDa, according to the theoretical molecular weight of HGFSP protein. Further identification of immunological characters of recombinant virus is under way.

恶性疟原虫保护性抗原复合基因-痘苗病毒重组活疫苗株的构建

将本实验室合成的一段编码恶性疟原虫不同发育阶段抗原表位基因，包括裂殖子表面抗原ＭＳＡ１、ＭＳＡ２、环子孢子蛋白ＣＳＰ及环状体感染红细胞表面蛋白ＲＥＳＡ以及来自白细胞介素－１（ＩＬ－１）和破伤风类毒素（ＴＴ）上Ｔ细胞激活位点等的复合抗原基因（ＨＧＦＳＰ），先定向克隆人ｐＳＫ载体的ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ位点，后用ＥｃｏＲＩ单酶切、补平及用ＳａｃⅠ单酶切下的目的基因再定向克隆人痘苗病毒表达载体ＰＪ２－１６的ＳｍａⅠ、ＳａｃⅠ位点，转化ＴＧ－Ⅰ宿主菌，重组子经琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶分析及酶谱等鉴定，证实并筛选出了目的基因已插入到ＰＪ２－１６血凝素（ＨＡ）基因内的重组子，构建了恶性疟原虫抗原基因－痘苗病毒表达载体。将该重组表达载体与痘苗病毒天坛株经Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｍｉｎｅ处理，在Ｃｏｓ－７细胞内进行共转染和同源重组，转染物接种ＢＨＫ２１细胞，经鸡红细胞吸附试验挑选不吸附鸡红细胞的病毒斑（ＨＡ－），共筛选出两株ＨＡ－重组病毒，用抗该目的基因大肠杆菌表达蛋白抗体对重组病毒表达产物进行间接免疫荧光、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等试验证明，两株重组病毒中有一株可表达目的蛋白，蛋白分子量与按目的基因长度?

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1 DNA与改良痘苗病毒组合疫苗诱导小鼠抗体应答

目的探索DNA与改良痘苗病毒(MVA)组合免疫对增强恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP1)抗体应答的作用。方法以人工合成MSP1全基因为基础分别构建DNA免疫质粒VR1020/190和重组MVA,单用VR1020/190或与表达质粒GM-CSF共同对小鼠进行初始免疫后,用重组病毒追加强化,采用DNA/MVA组合方案免疫BALB/c小鼠,ELISA测定血清IgG及其亚类水平,经腹腔接种转基因伯氏疟原虫Pb-PfM19进行攻击。结果DNA免疫能有效诱导小鼠产生抗MSP1-190抗体,其终点稀释度为1∶2500,GM-CSF质粒共免疫组抗体的终点稀释度为1∶11150,抗体亚类的测定表明GM-CSF质粒显著促进了IgG1类抗体应答,MVA追加可使单独免疫组和共免疫组抗体分别增加53和10倍;两实验组产生了水平相近的抗19000抗体(1∶32000),其含量占血清中MSP1总IgG的1/4-1/3。经转基因伯氏疟原虫Pb-PfM19攻击后小鼠的存活时间并没有明显延长(P>0.05)。结论采用合成MSP1全基因进行DNA/MVA组合免疫可诱导小鼠产生显著的抗体应答,抗体的详细特性和保护作用正在进一步研究中。

恶性疟原虫保护性抗原复合基因痘苗病毒重组活疫苗株在换人血猕猴模的抗攻击试验

探讨恶性疟原虫保护性抗原复合基因 痘苗病毒重组活疫苗候选株在实验动物的抗疟原虫攻击能力 ,为下一步进入夜猴及人体试验奠定基础。方法 :利用多次部分换人血猕猴模经静脉输血法进行了抗疟原虫红内期虫体的攻击试验。结果 :在免疫后 1个月攻虫 ,重组痘苗病毒免疫猴从第 3天一直到第 12d的采血检查中均未发现疟原虫 ;非重组痘苗病毒(对照病毒 )免疫猴第 3天后原虫感染率上升 ,第 6天原虫感染率最高达到 6 .0 % ,而后原虫感染率逐渐下降 ,原虫持续时间为13天 ;空白对照猴第 3天后原虫感染率也上升 ,第 8天原虫感染率最高达到 2 .5 % ,而后原虫感染率逐渐下降 ,原虫持续出现时间为 12d。结论 :初步说明该候选疫苗株具有一定的抗恶性疟原虫红内期虫体攻击的能力。

恶性疟原虫保护性抗原复合基因—痘苗病毒重组活疫苗株家兔免疫血清及IgG对恶性疟原虫的体外抑制试验

用恶性疟原虫痘苗病毒重组活疫苗候选株的家兔免疫血清及纯化的ＩｇＧ 进行了恶性疟原虫的体外培养抑制试验，并与该目的基因的原核表达蛋白及全虫抗原进行了比较。结果在疟原虫的第一个生长周期内，重组痘苗病毒组的免疫血清抑虫作用最强（Ｐ＜ ０．０５），其次为全虫抗原及原核蛋白组；ＩｇＧ 则在第一及第二个生长周期均以原核表达蛋白组抑虫作用最强（ Ｐ＜ ０．０５） ，其次为重组痘苗病毒及全虫抗原组。说明重组痘苗病毒免疫血清及ＩｇＧ具有一定的体外抑制恶性疟原虫增殖作用，值得进一步深入研究。

恶性疟原虫保护性抗原复合基因-痘苗病毒重组活疫苗株免疫动物后诱发的Th1细胞免疫反应

目的 测定恶性疟原虫 -痘苗病毒重组活疫苗候选株免疫动物后产生白细胞介素 - 2 (IL- 2 )和干扰素 (IFN)的生物学活性水平。 方法 用 MTT法测定了其诱导的保护性细胞免疫反应 (Th1细胞免疫反应 )。 结果 用重组痘苗病毒在免疫家兔及大白鼠 4～ 6 wk后血清中 IL- 2的生物学活性增强 ,免疫后 6 wk家兔、大白鼠及小白鼠 3种动物血清中 IFN的生物学活性水平比免疫前明显升高。 结论 恶性疟原虫 -痘苗病毒重组活疫苗候选株免疫动物后可诱发机体产生

丙型肝炎病毒与恶性疟原虫复合多表位抗原基因在小鼠及家兔中免疫应答的研究

目的 :探讨丙型肝炎病毒 (HCV)及恶性疟原虫 (Pf)复合DNA疫苗的可行性。方法 :把HCV复合多表位抗原基因PCX与Pf复合基因AB克隆到带CMV启动子的真核表达载体pcDNA3中 ,构建真核表达载体pcDNA3 CAB ,肌肉注射免疫小鼠及家兔 ,检测其诱发特异性免疫应答水平及安全性。结果 :小鼠及家兔分别于免疫后第 6周及第 8周可检测到抗GZ PCX抗体 ,于第 10周达最高 ,滴度分别为 1:40 0及 1:3 2 0 0 ,但持续时间较短 ;免疫血清可识别Pf抗原 ;免疫动物还可产生针对GZ PCX融合蛋白的迟发性超敏反应 ;免疫后小鼠体重正常 ,肝脾脏未见明显肿大 ,具有良好的安全性。结论 :HCV Pf双价多表位DNA抗原基因在小鼠及家兔中可诱发特异性免疫应答 ,但抗体的持续时间较短。

恶性疟原虫AMA1不同类型疫苗组合免疫接种研究

目的探索应用恶性疟原虫DNA疫苗、重组痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗进行组合免疫接种,诱导针对恶性疟原虫红内期抗原AMA1的保护性抗体。方法PCR扩增云南株恶性疟原虫AMA1编码基因,构建和制备DNA免疫质粒VR1020/E(疫苗D)、重组改良安卡拉痘苗病毒rMVAPE(疫苗V)和重组原核表达AMA1胞外域蛋白E(疫苗P)。用疫苗D单独或与小鼠GM2CSF表达质粒共同对小鼠进行初始免疫,用疫苗V和疫苗P进行单次或先后各一次追加强化。采用疫苗D2V组合方案免疫新西兰白兔。ELISA测定小鼠血清IgG及其亚类IgG1和IgG2a的水平,用免疫动物血清进行疟原虫裂殖子体外入侵抑制实验。结果在疫苗D初始免疫的基础上,采用疫苗V或疫苗P进行强化免疫可显著提高小鼠针对AMA1的抗体应答,小鼠血清特异性IgG平均增加15至137倍,GM2CSF表达质粒对疫苗D2V组合免疫小鼠的抗体应答有显著促进作用。采用疫苗D2V组合免疫在家兔可诱导明显的抗体应答。小鼠和家兔免疫血清在体外可显著抑制疟原虫裂殖子对RBC的入侵。结论将DNA疫苗、重组改良安卡拉痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗进行组合免疫接种是诱导疟疾红内期保护性抗体的有效方法。

携带恶性疟原虫ama1基因的重组MVA构建及免疫性分析

目的 构建稳定表达恶性疟原虫 (Pf)顶端膜抗原 1(AMA1)的重组改良安卡拉痘苗病毒 (MVA) ,对其诱导小鼠免疫应答的特性进行分析。方法 构建包含PfAMA1编码基因的重组载体pⅢdHR .ssp E ,转染MVA感染的BHK2 1细胞 ,经同源重组插入MVA基因组的deletionⅢ位点 ,利用宿主范围基因k1l在RK13细胞中对rMVA进行瞬时筛选 ,用获得的rMVA E(K1L)感染BHK2 1并进行传代 ,经内部同源重组去除k1l后获得rMVA E。采用PCR、IFA和Westernblot对rMVA E的基因组序列和重组抗原的表达情况进行鉴定。用不同剂量的rMVA E经腹腔接种免疫BALB c小鼠 ,ELISA检测特异性抗体应答的水平并分析IgG亚类 (IgG1和IgG2a) ,取脾细胞用重组抗原在体外进行刺激增殖。结果 获得了可稳定表达PfAMA1的重组MVA ,经 3次腹腔接种不同剂量 (10 7～ 10 8TCID50 )后的rM VA E诱导BALB c小鼠产生了水平相当 (P >0 .1)的抗AMA1抗体 ,其IgG亚类以IgG2a为主 ,各免疫组脾细胞在体外对AMA1抗原的再刺激均产生了明显的回忆应答。结论 成功构建了携带Pfama1基因的重组MVA。rMVA E可诱导小鼠产生AMA1特异的免疫应答。

恶性疟原虫抗原—痘苗病毒重组活疫苗株的实验室评价

以恶性疟原虫保护性抗原复合基因—痘苗病毒重组活疫苗候选株为研究对象 ,探索其免疫血清及IgG的体外抗疟原虫能力、保护性细胞免疫反应及换人血猕猴模型动物抗攻击能力试验。结果表明 ,受检免疫血清及IgG具有一定的体外抑制恶性疟原虫增殖作用。家兔及大白鼠免疫后 4～ 6周血清中可产生明显的IL 2活性 ,免疫后 6周家兔、大白鼠及小白鼠血清IFN的活性水平比免疫前明显升高。免疫后 1个月攻虫 ,免疫猴从第 3天一直到第 12天血检中均未发现疟原虫 ;而非重组痘苗病毒免疫猴第 3天后原虫感染率上升 ,第 6天原虫感染率最高达到 6 0 % ,而后原虫感染率逐渐下降 ,持续 13d ;空白对照猴第 3天后原虫感染率也上升 ,第 8天原虫感染率最高达到 2 5 % ,而后原虫感染率逐渐下降 ,持续 12d。结果初步表明该候选疫苗株具有一定的诱发体液免疫、细胞免疫反应及抗虫体攻击能力 ,值得做进一步的研究。

丙型肝炎病毒及恶性疟原虫复合抗原基因表达及诱导小鼠免疫应答的研究

将合成的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）复合多表位抗原基因ＰＣＸ及恶性疟原虫（Ｐｆ）多价抗原基因ＡＢ（ＳＰｆ６６＋ＳＰｆ１０５）克隆到表达载体ｐＷＲ４５０ｌ中，以β半乳糖甘酶（ＧＺ）ＨＣＶＰｆ复合多肽抗原的形式在大肠杆菌中高效融合表达了目的蛋白ＧＺＣＡＢ，表达量约３０％。所表达的重组抗原可被ＨＣＶ患者血清及鼠抗Ｐｆ抗体特异识别，显示了该融合蛋白质具有ＨＣＶ和Ｐｆ的免疫原性。该蛋白免疫小鼠后，诱发针对ＧＺＣＡＢ、ＧＺＰＣＸ及ＰｆＡｇ的特异性体液免疫应答及针对ＧＺＣＡＢ、ＧＺＰＣＸ的迟发性超敏反应，ＣＤ８＋Ｔ细胞明显升高，提示该复合抗原作为ＨＣＶＰｆ双价疫苗的可行性。