恶性疟原虫海南分离株pfmdr1基因与氯喹抗性的相关性分析

目的了解海南省恶性疟原虫pfmdr1基因同氯喹抗性的关系。方法采用套式PCR技术特异性扩增pfmdr1基因含有编码第86位、1042位和1246位氨基酸的基因片段,并对扩增产物进行RFLP分析。结果42个样本中,pfmdr1第86位氨基酸均未发生突变,即86位氨基酸是野生型的Asn,而不是突变型的Tyr。第1246位氨基酸发生突变的样本共有7个,全部为抗性虫株。第1042位点PCR扩增结果阳性的37个样本中突变的样本共有10个,其中9个为抗性虫株,一个为敏感虫株。结论我国海南省恶性疟原虫氯喹抗性产生与pfmdr186位氨基酸基因多态性无关,但第1042和1246位氨基酸的突变更易在抗性虫株中检出。

海南省恶性疟原虫氯喹抗性相关基因Pfmdr1多态性分析

目的了解海南省恶性疟原虫Pfmdr1基因中的关键性点突变是否与海南株恶性疟原虫产生氯喹抗性有关。方法采用套式PCR法分别扩增Pfmdr1基因中含有第86位和1246位氨基酸的多态性片段,并对扩增产物进行限制性内切酶酶切分析,观察是否存在突变位点。结果45个样本中,Pfmdr1基因第86位氨基酸均未发生点突变,即86位密码子是Asn而非突变型的Tyr;Pfmdr1基因发生D1246Y突变的样本有3个,其中1个是抗性株,2个为敏感株。结论我国海南株恶性疟原虫产生氯喹抗性与Pfmdr1基因的多态性无显著关系。

用pfcrt点突变基因检测技术检测恶性疟原虫氯喹抗药性的初步研究

目的 建立一种恶性疟原虫氯喹抗药性基因pfcrt点突变的检测方法,以判断是否存在氯喹抗药性。方法 根据恶性疟原虫pfcrt基因序列设计巢式PCR引物,以恶性疟原虫DNA为模板扩增出一条包含第76位密码子的DNA片段;扩增产物经限制性内切酶Apo I消化,用琼脂糖凝胶电泳观察恶性疟原虫pfcrt等位基因是否为突变型。结果 31份样本经巢式PCR扩增均出现14 0 bp左右的特异性片段。酶切消化后,9份滤纸血样本中有4例出现1条14 0 bp左右的片段,为突变型pfcrt等位基因,其余5份出现97bp与4 8bp两种酶切片段,为野生型pfcrt等位基因;2 2份血涂片样本中有10份突变型,突变率为4 5 .16 %。14例突变样本中,有1例体内实验氯喹治疗有效。结论 巢式PCR- RFL P法可以快速、高效的检测恶性疟原虫pfcrt基因76位密码子的点突变,并且能够初步应用于恶性疟原虫氯喹抗药性的鉴别。

海南恶性疟原虫pfcrt等位基因多态性的单体型研究

目的建立恶性疟原虫pfcrt(Plasmodium falciparum chloroquine resistant transporter)等位基因多态性的单体型的研究疗法,比较我国海南省与东南亚及非洲地区恶性疟原虫的pfcrt等位基因多态性的单体型的特征。方法来自海南省19份恶性疟滤纸血样提取DNA,通过巢式PCR反应,扩增出包含第72～76、97位密码子的基因片段,根据限制性片段长度多态性(RFLP)分析结果,各选取6份突变型和野生型PCR产物进行DNA测序,检测第72～76、97位密码子序列,从而建立并分析我国海南省恶性疟prcrt等位基因的单体型。结果19份滤纸血样本提取的DNA全部扩增出1条195 bp的片段,酶切消化后,有11份出现1条100 bp左右的酶切片段,为野生型pfcrt等位基因,其余8份为1条195 bp的片段,为突变型。基因序列分析发现,野生型pfcrt等位基因的第72～76位密码子单体型为CVMNK,突变型为CVIET,第97位密码子未发现突变。结论我国海南省氯喹抗药性恶性疟原虫pfcrt等位基因第72～76位密码子的单体型与东南亚和非洲地区抗氯喹恶性疟原虫相应单体型一致。

云南恶性疟原虫氯喹抗药性基因76位点突变研究

目的研究云南恶性疟原虫氯喹抗药性基因(pfcrt)76位点突变的情况,以及与抗药性表现型的关系。方法应用PCR和限制性酶切片段长度分析方法,检测现症病人干滤纸血样的恶性疟原虫pfcrt基因点突变。结果云南省恶性疟原虫pfcrt基因76位点的突变型很高,占85.0%(51/60);野生型和混合型较少,分别占8.3%(5/60)和6.7%(4/60)。体内法测定的氯喹抗性和敏感样本均有pfcrt76突变型;体外法测定的17份氯喹抗性样本中,有13份带有pf-crt76突变型。结论云南省恶性疟原虫pfcrt基因氨基酸编码76位点突变频度很高。体内和体外法测定的氯喹抗性表现与pfcrt76突变型有较高的一致性。

海南省恶性疟原虫氯喹抗性相关基因pfcrt多态性分析

目的了解海南省恶性疟原虫产生氯喹抗性是否与pfcrt基因中的关键性点突变有关。方法对45份采自海南省恶性疟患者血样,采用套式PCR法分别扩增pfcrt基因中含有第76位和220位氨基酸的多态性片段,并对扩增产物进行限制性内切酶酶切分析,观察是否存在突变位点。结果45个样本中,pfcrt基因发生K76T点突变的样本有28个,其中20个是抗性株,8个是敏感株;全部样本的pfcrt基因第220位氨基酸均发生A220S点突变。结论我国海南株恶性疟原虫产生氯喹抗性与发生在pfcrt基因中的K76T点突变有一定的关联。

云南省恶性疟原虫多药抗性基因^(Asn)86^(Tyr)多态性调查

目的检测云南恶性疟原虫多药抗性基因 (Pfmdr1 ) Asn 86Tyr的多态性 ,探索其与氯喹敏感性表现型的关系。方法用等位基因特异 PCR和限制性酶切片段长度分析技术 (AS-PCR/RFLP)。结果在 86% (1 9/2 2 )的氯喹抗性分离株中检测到 Pfmdr1基因的 Asn86Tyr两种多态性 ,携带编码 86Tyr多态变异的占 50 % ,而含编码 Asn86多态的也是 50 %。结论在云南氯喹抗性高度流行区 ,Pfmdr1基因

海南省恶性疟原虫cg2基因ω重复区多态性与氯喹抗性关系分析

目的了解海南省恶性疟原虫cg2基因ω重复区多态性与氯喹抗性的关系。方法采用套式PCR技术特异扩增恶性疟原虫海南分离株cg2基因ω重复区 ,并对部分目的基因片段进行直接测序和序列分析。结果氯喹抗性株和敏感株均可扩增得到cg2基因ω重复区 ,大小约在 180bp至 5 5 0bp之间。

赤道几内亚Bioko岛的恶性疟原虫多药抗性基因(pfMDR-1)的研究

目的对赤道几内亚Bioko岛上恶性疟原虫多药抗性基因(pfMDR-1)进行分析,为Bioko岛的疟疾防控和治疗提供依据。方法2012年雨季期间采集的恶性疟原虫感染患者样本151份,用巢式PCR技术特异性扩增N86Y、E130K、Y184F、S1034C、N1042D、V1109I、D1246Y耐药分子标记的pfMDR-1基因片段,然后进行测序分析。结果虫株中共发现了4种不同的单倍型:YEY/SNVD、NEF/SNVD、YEF/SNVD和NEY/SNVD。91.39%(138/151)的样本发现了耐药性位点突变,包括3.31%(5/151)的86Y,29.80%的184F,和58.29%(88/151)的双重突变86Y/184F。结论结果表明赤道几内亚Bioko岛上的恶性疟原虫株存在较高比例耐药基因突变和耐药复合基因突变,为当地的抗疟疾选用药物提供指导。

酮替芬和赛庚啶增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹反应性的研究

目的研究酮替芬和赛庚啶增强体外培养的恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹反应性,及其增效机制。方法恶性疟原虫氯喹抗性株(FccSM1/yN株)取自云南省思茅地区恶性疟患者静脉血,经同步化处理,用新鲜血将红细胞感染率调至0.5%～1.0%,红细胞压积与培养基体积比(红细胞比容)为1∶9,混匀。制备氯喹药板及氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)组合药板。氯喹药板自上而下每行氯喹终浓度依次为0.3125～2560nmol/L,呈2倍递增。氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)组合药板,是在氯喹药板基础上加入酮替芬(或赛庚啶),每行10孔自左至右终浓度依次为9.77～5000nmol/L,呈2倍递增,每块药板均设A行空白对照。每孔加混匀血样50μl,37℃培养34h,镜检计数每200个疟原虫中含3个核以上裂殖体数,计算氯喹单药及各配伍组对恶性疟原虫的半数抑制浓度(IC50),以及酮替芬(或赛庚啶)提高氯喹活性的指数(AEI)。选择AEI值较高的配伍组,进行增效时序性研究。当氯喹对虫体作用0～10h分别加入酮替芬(或赛庚啶),34h后检测和计算各时间段IC50及AEI。选择氯喹/酮替芬(或氯喹/赛庚啶)最佳配伍剂量,培养恶性疟原虫20h,提取总RNA,用实时荧光定量PCR(real-timePCR)分析药物作用前后恶性疟原虫氯喹抗性转移基因(pfcrt)和多药抗性基因(pfmdr1)表达水平。结果0.3125～2560nmol/L氯喹与625nmol/L酮替芬(或赛庚啶)配伍,增效作用显著,氯喹/酮替芬的IC50为74.53nmol/L,AEI为0.42;氯喹/赛庚啶的IC50为89.70nmol/L、AEI为0.30。5nmol/L氯喹作用6～7h加入625nmol/L酮替芬(或赛庚啶),增效作用显著,氯喹/酮替芬的IC50为67.70nmol/L、AEI为0.47;氯喹/赛庚啶的IC50为81.53nmol/L、AEI为0.37。5nmol/L氯喹与625nmol/L酮替芬(或赛庚啶)配伍,作用20h,氯喹/酮替芬可使pfcrt基因表达水平升高91%,而氯喹/赛庚啶可使pfmdr1基因表达水平下降14%。结论体外氯喹与适量的酮替芬(或赛庚啶)配伍,能增强恶性疟原虫氯喹抗性株对氯喹的反应性。氯喹对虫体作用6～7h加入酮替芬(或赛庚啶)增效作用显著。该增效作用与pfcrt基因和pfmdr1基因的表达水平有关。

输入性恶性疟原虫Pfcrt和pfmdr1基因突变关联性分析

目的了解输入性恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Pfcrt)和恶性疟原虫多药抗性基因1(pfmdr1)相关位点突变情况及其关联性。方法 2009-2016年,采集武汉市从非洲和东南亚等回国人员恶性疟患者血样,利用巢式PCR扩增恶性疟原虫Pfcrt和pfmdr1基因,分别用限制性内切酶ApoⅠ、AseⅠ和EcoRv对产物进行酶切,分析相关位点的突变性。结果 232例输入性恶性疟患者Pfcrt76和pfmdr186、1042、1246位点的突变率分别为55.2%、17.2%、5.2%和8.6%,pfmdr1总突变率为26.3%;东南亚患者血样未检出pfmdr186和pfmdr11246位点突变;非洲输入性恶性疟患者Pfcrt76突变和未突变中pfmdr186、1042、1246位点及pfmdr1总突变率分别为28.6%、3.8%、12.4%、36.2%和10.4%、2.1%、7.3%、17.7%。患者症状与Pfcrt76、pfmdr186、1042、1246位点突变连锁不平衡分析,D′和r^2分别为0.230和0.018、0.290和0.004、0.996和0.012、0.150和0.035。结论输入地为非洲和东南亚缅甸的恶性疟原虫pfmdr1基因突变位点存在差异,Pfcrt76突变与pfmdr1突变和pfmdr186点突变呈正相关。

恶性疟原虫pfcrt基因K76T与氯喹抗性的相关分析-Meta分析

目的采用meta分析的方法探讨pfcrt K76T、与恶性疟氯喹抗性相关性。方法检索主要的医学数据库，按一定的人选和排除标准筛选相关文献，共纳入11项研究结果，采用Rev Man5对pfcrt K76T与恶性疟原虫氯喹抗性的关系进行meLa分析。结果pfcrt K76T与恶性疟氯喹抗性具有明显相关性，有统计学意义（OR=6．60，95％（CI=3．46～12．59，Z=5．73，P〈0．00001）。结论pfcrt K76T与恶性疟氯喹抗性具有明显相关性，应进一步研究，为抗疟疫苗、抗疟药物的研究和分子诊断提供科学依据。

2012年和2018年我国输入性恶性疟原虫氯喹抗性基因多态性分析

目的对2012年和2018年我国输入性恶性疟原虫样本氯喹抗性分子标记位点基因多态性进行检测,分析恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Plasmodium falciparum chloroquine re sistant transporter,Pfcrt)第72~76位密码子抗性相关位点突变类型,并分析不同输入来源样本的特异性。方法收集2012年和2018年国家疟疾诊断参比实验室674例输入性恶性疟病例滤纸血样本,以样本中恶性疟原虫7号染色体上Pfcrt基因第72~76位点为扩增片段,采用巢式PCR法进行扩增并测序,对目的产物片段测序结果、地理分布等特征进行统计分析。结果2012年和2018年我国674例输入性恶性疟病例中,95.5%(644/674)来自非洲,其余4.5%(30/674)来自东南亚和大洋洲(巴布亚新几内亚);非洲又以西非和中非为主(占非洲样本的80.4%,518/644)。共检测到C72S、M74I、N75E、K76T 4个位点突变和5种单体型类型(CVMNK、CVIET、SVMNT和两种混合型),其中CVMNK与CVIET为非洲和东南亚地区恶性疟原虫共有的单体型类型,SVMNT仅在东南亚(缅甸)和巴布亚新几内亚输入样本中检测出;2种混合型为CVMNK/CVIET和CVMNK/SVMNT,前者在非洲和东南亚输入样本中分布,后者仅在东南亚缅甸来源样本中检出。自非洲输入的样本野生型较多,占77.7%(478/615);而自东南亚和巴布亚新几内亚输入的样本中,抗性分子标记样本占68.0%(17/25),两者差异有统计学意义(χ^2=28.5,P<0.05)。非洲不同地区来源样本中,抗性基因比例和野生型构成差异有统计学意义(P<0.01),西非野生型所占比例最低。结论2012年和2018年我国674例输入性恶性疟病例样本中,自东南亚输入的恶性疟原虫Pfcrt基因第72~76位点抗性基因比例和分子多态性均较非洲来源样本高。

长沙市122例输入性恶性疟原虫多药抗性基因1拷贝数变异分析

为了解输入性恶性疟原虫多药抗性基因1 (Pfmdr1)拷贝数变异(CNV)情况,对长沙市2016—2019年输入的恶性疟患者滤纸干血斑样品中Pfmdr1与恶性疟原虫微管蛋白基因(Pftub)进行实时荧光定量PCR检测,以Pftub基因为参比基因,计算获得样品的Pfmdr1 CNV值。采用SPSS 23.0统计学软件对检测结果和治疗信息进行统计分析。结果显示,122份血样中有18份发生Pfmdr1 CNV变异,变异率为14.8%(18/122)。2016—2019年血样Pfmdr1 CNV均值分别为1.020±0.076、 1.136±0.403、 1.387±0.657和1.142±0.349。变异血样输入地来源为赤道几内亚、安哥拉、贝宁、塞拉利昂、刚果民主共和国、尼日利亚、喀麦隆、加纳和刚果共和国。输入地为东非、西非和中非的患者血样Pfmdr1 CNV均值分别为0.999±0.073、 1.150±0.368和1.249±0.448。东非和西非、中非相比差异有统计学意义(t=2.663、 3.995,P <0.05)。变异血样的患者平均用药时长为(5.93±0.94) d,长于非变异血样患者的(3.21±1.23) d (t=8.930,P <0.01)。治疗结束后1个月变异血样的患者再燃2例,非变异血样的患者再燃1例(似然比χ^(2)=3.831,P <0.05)。治疗结束后1年变异血样的患者再燃2例,非变异血样的患者再燃1例(似然比χ^(2)=5.372,P <0.05)。血涂片中存在配子体的变异血样5例,非变异血样3例(似然比χ^(2)=10.599,P <0.01)。长沙市输入性恶性疟原虫存在Pfmdr1 CNV变异,变异会造成患者治疗时间延长和原虫不能完全清除。

武汉市输入性恶性疟原虫多药抗性基因1相关位点突变分析

目的了解武汉市输入性恶性疟原虫多药抗性基因1(Plasmodium falciparum multidrug resistance 1,Pfmdr1)相关位点突变情况。方法2010-2015年,采集武汉市从非洲和缅甸等疟疾流行区回国人员中确诊为恶性疟的患者血样。根据恶性疟原虫Pfmdr1 86、1042和1246基因位点设计巢式PCR引物,巢式PCR扩增恶性疟原虫Pfmdr1基因,分别用限制性内切酶ApoⅠ、AseⅠ和Eco RⅤ酶切扩增产物,分析其86、1042和1246位点的突变率。结果共检测恶性疟现症患者血样187份,全部成功扩增出Pfmdr1基因,86、1042和1246位点突变率分别为19.3%(36/187)、4.3%(8/187)和9.6%(18/187)。其中非洲输入性疟疾血样175份,86、1042和1246位点突变率分别为20.6%(36/175)、2.9%(5/175)和10.3%(18/175);缅甸输入性疟疾血样12份,其中3例检出1042位点,未检出86位点和1246位点突变。结论来自非洲的输入性恶性疟原虫Pfmdr1基因86、1042和1246位点均检出点突变,来自缅甸的输入性恶性疟原虫Pfmdr1基因只检出1042位点发生突变。