基于无性期18S rDNA特异性引物检测5种疟原虫qPCR的建立和应用

目的建立基于疟原虫无性期(A期)18S rDNA检测感染人的5种疟原虫的qPCR,并评价其检测效果。方法从GenBank中下载5种疟原虫A期、子饱子期(S期)、卵囊期(O期)和人的18S rDNA序列进行比对,划分保守区和变异区,在保守区设计疟原虫属特异性引物,在变异区设计种特异性引物。以5种疟原虫DNA、田鼠巴贝虫和婴儿利什曼原虫DNA为模板进行qPCR扩增,筛选特异性引物对。应用qPCR法筛选特异性引物对的最佳退火延伸温度和引物浓度。分别构建5种原虫A期18S rDNA短片段(筛选出的引物对扩增产物)和长片段(属特异性引物扩增产物)质粒,以连续浓度梯度的短片段质粒DNA[(5×10^(1))~(5×10^(8))拷贝/μl]、长片段质粒DNA[(5×10^(4))~(5×10^(9))拷贝/μl]为模板分别进行qPCR扩增,测定筛选出的引物对的扩增效率、最低检出限[包括最低质粒浓度、循环数阈值(Ct值)、变异系数]、无扩增时非目标DNA的最高浓度、可检出的混合DNA中不同虫种间的最大拷贝浓度比值。以5倍稀释的18份疟原虫血样DNA[恶性疟原虫(Pf)6份、间日疟原虫(Pv)6份、卵形疟原虫(Po)4份、三日疟原虫(Pm)2份、诺氏疟原虫(Pk)1份]为模板,应用筛选出的特异性引物分别进行qPCR、一步反转录qPCR和巢式PCR扩增,计算最低检出限时的原虫密度。用筛选出的特异性引物进行应用验证,对70份疟疾患者血样DNA(Pf 26份、Pv 14份、Pm 14份、Po 9份、Pk 3份、混合感染4份)、65份疟原虫阴性人血样DNA以及阿米巴(1份)、田鼠巴贝虫(1份)和杜氏利什曼原虫DNA(3份)进行qPCR扩增,以样品提供者的检测结果为标准,计算qPCR检测的敏感度、特异度、符合率。不同PCR方法检测结果的比较采用卡方检验、t检验、Mann-Whitney检验或Wilcoxon秩和检验。结果序列比对结果显示,5种疟原虫A期18S rDNA序列的一致性为89.3%~96.7%,高于S期的60.0%~92.1%,可分为9个保守区和8个变异区。除Pv O期和Pm S期18S rDNA外,保守区序列长度相同,一致性≥92%。筛选获得1对属特异性引物和5对种特异性引物,各引物对的qPCR扩增效率为90.6%~98.8%,qPCR扩增的最佳退火延伸温度为57.8℃,最佳引物终浓度为0.3μmol/L。6对特异性引物的qPCR检出的最低质粒浓度均为5×102拷贝/μl,对应Ct值为32.3~33.1,变异系数为0.5%~3.7%。5对种特异性引物qPCR扩增非目标DNA结果均为阴性时非目标DNA的最高浓度为(5×10^(6))~(5×10^(8))拷贝/μl,可检出的混合质粒中不同虫种间的最大拷贝浓度比值均为104。一步反转录qPCR、qPCR和巢式PCR可检出的最低原虫密度平均值分别为(4.1±5.1)、(6.0±4.3)和(8.2±2.9)虫/μl血,最低值分别为0.01、0.3和2.0虫/μl血,变异系数分别为125.6%、72.2%和35.8%,一步反转录qPCR检出最低原虫密度的敏感性高于另两种方法(Wilcoxon秩和检验,Z=-2.0、-2.0,均P<0.05),qPCR和巢式PCR的敏感性差异无统计学意义(t=-1.7,P>0.05)。应用验证结果显示,qPCR的敏感度和特异度均为98.6%,qPCR检测结果与标准结果的符合率为98.6%,差异无统计学意义(χ^(2)=0.0,P>0.05)。结论建立了基于疟原虫A期18S rDNA的qPCR检测系统,可用于鉴定常规疟疾血样。