中国恶性疟原虫氯喹抗药性相关基因Pfcrt 72-76位点基因型分析

目的了解我国云南和海南恶性疟原虫分离株Pfcrt基因72-76位点基因型,并分析该位置不同基因型与恶性疟原虫对氯喹敏感性的关系。方法从我国恶性疟流行区云南和海南省采集恶性疟现症患者血样,根据恶性疟原虫Pfcrt基因序列设计引物,进行巢式PCR扩增和测序。采用WHO制定的体外微量法测定同批血样中恶性疟原虫对氯喹的敏感性。结果云南、海南省恶性疟原虫Pfcrt基因第72-76位编码的氨基酸单元型在氯喹敏感株均为CVMNK。其中海南的氯喹抗性株Pfcrt基因第72-76位编码的氨基酸为单一的CVIET单元型,云南氯喹抗性株中除一株为CVIKT,另1株为SVMNT外,均为CVIET单元型。结论我国云南、海南省恶性疟原虫氯喹敏感株Pfcrt基因第72-76位编码的氨基酸基因型为CVMNK。抗性株主要为CVIET型,Pfcrt基因第72-76位编码氨基酸基因型可作为氯喹抗性分子标志。

恶性疟原虫顶端膜抗原1基因多态性分析

目的研究不同地理分离株恶性疟原虫裂殖子顶端膜抗原1(Pf AMA-1)基因的多态性。方法采集2006-2012年福建省23例输入性恶性疟患者的血样,以血样中的疟原虫DNA为模板,巢式PCR扩增AMA-1基因片段,利用生物软件进行序列比对分析。结果 23份血样均扩增出目的条带(约505 bp),发现32个多态位点,共计18个单倍型,其中8个为新报道序列。来自非洲的恶性疟原虫分离株的AMA-1基因序列具有较丰富的遗传多样性[单倍型多样度(Hd)=0.985,核苷酸多样度(π)=0.0258],亚洲(东南亚和中国云南)的遗传多样性相对较低(Hd=0.909,π=0.0221)。多样化选择分析结果显示,非同义突变率与同义突变率差值(d N-d S)为0.031±0.006,中性检验结果均无统计学意义(P>0.05)。基因内重组分析显示,重组事件的最低数量(Rm)为10,连锁不平衡指数R2随核苷酸遗传距离增加呈明显下降趋势。采用邻接法构建的分子系统树显示,所有分离株分为3个群(G1,G2和G3),G1多为非洲分离株,G3大部分为亚洲分离株。结论来自非洲的恶性疟原虫分离株的AMA-1基因序列具有较丰富的遗传多样性。

抗恶性疟原虫Fcc7801/HN株单克隆抗体的制备

用海南省恶性疟原虫Fcc7801/HN株抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经3次克隆化,获得4株(C6,H6,B6,2H6)分泌抗恶性疟原虫红内期单克隆抗体的杂交瘤细胞株。其中C6,B62株单克隆抗体(McAb)有显著的抑制恶性疟原虫体外生长的作用,免疫印迹法检测它们均能识别分子量为71kD的疟原虫抗原,提示此抗原具有免疫保护作用。4株McAb能与恶性疟原虫Fcc-1/HN,Fcc7802/HN、Fcc8703/JS以及伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫发生交叉免疫荧光反应,说明这些疟原虫之间存在着共同的抗原决定簇,这为疟疾免疫学研究和血清诊断学提供了有利条件。