真菌防御素plectasin研究进展

抗生素耐受现象日益严重,迫切需要研发新型抗菌药物。Plectasin是第一例报道的真菌防御素,其抗菌谱窄,仅对革兰氏阳性菌具有强大的杀菌活性,对其进行结构改造可进一步提高其抗菌作用特异性。Plectasin抗菌机制明晰,作用于细胞壁合成。其药物代谢动力学研究较为透彻,同时可在体外高产量表达且活性更高。这些研究为其应用提供了理论基础。综上,plectasin具有极大的临床应用潜力。

抗菌肽Plectasin的新型体外折叠方法与活性鉴定

在体外条件下,通过体外折叠体系折叠化学合成的Plectasin,经过HPLC纯化及圆二色谱仪(CD)进行结构鉴定。以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),耐万古霉素肠球菌(VREF)及耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)为实验菌株,用微量肉汤稀释法测定Plectasin对耐药菌的最小抑菌浓度(MIC)。结果:经体外折叠的Plectasin通过HPLC进行纯化,样品峰约在44.8 min出现,回收率约15%;圆二色谱鉴定显示,折叠后的Plectasin分子结构与折叠前不同,和天然构象类似;折叠活化的Plectasin对MRSA、VREF及PRSP的MIC分别为28,14,28μg/m L。通过体外折叠体系折叠化学合成的Plectasin抗菌肽,能使其获得与天然构象相当的抗菌活性。

抗菌肽Plectasin原核表达条件的正交试验优化研究

为提高重组抗菌肽Plectasin的表达量,对构建的Plectasin重组表达载体p E-SUMO-PS的表达条件进行正交试验优化。根据Plectasin氨基酸序列合成了Plectasin基因,通过限制性内切酶Xba I和Bsa I插入表达载体p E-SUMO中,转化E.coli Origami(DE3),IPTG诱导表达。选取诱导时间,诱导浓度和诱导温度共3个主要外部因素。采用3因素3水平正交试验设计,通过SDS-PAGE测定重组表达蛋白。以标准SDS-PAGE图法分析目的融合蛋白含量,以单位上清体积内融合蛋白量作为检测指标,结果用SPSS13.0软件进行统计分析。实验成功构建了重组表达载体p E-SUMO-PS,且融合蛋白主要是以可溶性蛋白为主。在30℃,0.05 mmol/L IPTG的条件下诱导6 h所得融合蛋白量最大。影响抗菌肽Plectasin融合表达的因素的强度由高到低分别为诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度。通过正交试验得出抗菌肽Plectasin原核表达的最佳诱导条件为30℃,6 h和0.05 mmol/L IPTG。这对于抗菌肽Plectasin的后续纯化及产业化具有重要参考价值。

毕赤酵母Kar2p过表达对假黑盘菌素表达量的影响

Kar2p是一种分子伴侣蛋白,为研究其对外源蛋白在毕赤酵母中表达的影响,从毕赤酵母菌株GS115中克隆出编码该蛋白的基因,利用其对毕赤酵母转化子P-Ple进行二次转化,获得了能够同时过表达假黑盘菌素和Kar2p的二次转化子P-Ple Kar;采用荧光定量PCR方法,对P-Ple和P-Ple Kar两个转化子中的Kar2p转录水平进行了测定发现,在P-Ple Kar中Kar2p的转录水平比P-Ple上调了约18倍。对P-Ple和P-Ple Kar两个转化子的生长曲线进行比较,发现Kar2p过表达对宿主细胞的生长无明显影响,但对外源蛋白假黑盘菌素的表达确实产生了一定的抑制作用,受Kar2p的影响,在诱导培养48 h时,假黑盘菌素的最高抑菌活性明显降低。这种抑制表达不单针对假黑盘菌素,对毕赤酵母的蛋白酶表达和分泌也同样起到了一定的抑制作用,具体表现在分泌到培养液中的假黑盘菌素在发酵后期仍然能保持较高抑菌活性,没有被发酵液中的累积的蛋白酶快速降解。与P-Ple相比,P-Ple Kar假黑盘菌素的表达量虽略有降低,但可以维持更长时间的稳定表达。

重组菌丝霉素发酵培养基筛选及重组菌丝霉素在断奶仔猪上的应用

本试验旨在对重组菌丝霉素发酵培养基进行优化筛选,并研究饲粮中添加重组菌丝霉素对断奶仔猪生长性能、养分消化率和肠道微生物菌群的影响。试验利用30 L发酵罐对毕赤酵母基因工程菌(PPle)进行液体发酵,采用分批-补料式发酵工艺,比较低盐、基础甘油和基础可溶性淀粉3种不同培养基对重组菌丝霉素分泌表达的影响。动物试验选用30头24日龄健康的"杜长大"断奶仔猪,按体重一致原则随机分配到5个组:对照组(CON组,基础饲粮)、硫酸黏菌素组(CS组,基础饲粮+0.3%硫酸黏杆菌素)、抗菌肽组(AP组,基础饲粮+0.2%重组菌丝霉素)、微生态制剂组(PB组,基础饲粮+0.1%微生态制剂)和联合应用组(PPB组,基础饲粮+0.2%重组菌丝霉素+0.1%微生态制剂),试验期21 d。结果表明:发酵到114 h,低盐组、基础甘油组和基础可溶性淀粉组菌体湿重达到最高,分别为450、402、277 g/L。发酵114 h,测得发酵上清液蛋白总浓度低盐组0.38 g/L、基础甘油组3.94 g/L、基础可溶性淀粉组5.63 g/L。动物试验表明,与CON组相比,CS组和AP组显著提高了平均日采食量(ADFI)和平均日增重(ADG),显著降低了料重比(F/G)(P<0.05)。与CON组相比,CS组和AP组有降低腹泻率的趋势(0.05<P<0.10)。与其余各组相比,AP组显著提高了回肠食糜双歧杆菌的含量(P<0.05)。与CON组相比,其余4个组有提高能量和干物质表观消化率的趋势(0.05<P<0.10)。PB组磷的表观消化率极显著高于其余4个组(P<0.01)。综上所述,通过优化培养基,提高了重组菌丝霉素的表达量,在断奶仔猪饲粮中添加重组菌丝霉素可改善仔猪的生长性能。

菌丝霉素MP1106融合蛋白的复性及纯化方法

旨在建立高效、快捷的菌丝霉素衍生物MP1106大肠杆菌表达系统。通过基因融合的方式构建生物表面活性剂-菌丝霉素衍生物(DAMP_4-MP1106)融合蛋白表达载体,在大肠杆菌中进行表达;并对目的蛋白MP1106进行分离纯化和分子内二硫键鉴定。结果显示,融合蛋白DAMP_4-MP1106在大肠杆菌中以包涵体的形式成功表达,表达产物在变性条件下经Ni^(2+)-NTA亲和层析纯化;经检测分析,摇瓶中DAMP_4-MP1106的发酵产量为118 mg/L,纯度为94.7%;采用96孔板筛选并建立复性方法,获得水溶性融合蛋白DAMP_4-MP1106;并经TEV蛋白酶酶切以及二次Ni^(2+)-NTA亲和层析纯化,可获得纯度为99%的抗菌肽MP1106 18mg/L,回收率达到了38.4%。通过简捷方法快速鉴定分子内的二硫键,初步证实了抗菌肽MP1106完成了分子内结构正确折叠。建立了高效快捷的菌丝霉素大肠杆菌表达系统。

菌丝霉素抑菌活性鉴定及其在防治牛乳腺炎中的应用

试验目的是通过毕赤酵母系统高效表达一种新的真菌防御素菌丝霉素,鉴定它的抑菌活性,并考察其对牛乳腺炎疾病的防治功能。将菌丝霉素基因克隆到酵母表达载体p Pic Zα中,转化并重组到毕赤酵母GS115中。经过甲醇诱导表达,分离纯化,进行体外抑菌活性鉴定。结果显示菌丝霉素在1μg/ml浓度下,对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌等起到抑制作用,对耐药性金黄色葡萄球菌的MIC为10~50μg/ml。鉴于上述细菌是引起奶牛乳腺炎的重要致病菌,我们将0.05%菌丝霉素蛋白灌注到奶牛乳腺中,经过7 d的治疗期,发现奶牛乳腺炎得到有效治疗或缓解。上述结果表明菌丝霉素在0.05%剂量下,对奶牛乳腺炎具有防治作用,可望开发为一种新兽药。

菌丝霉素分泌型丁酸梭菌防治罗非鱼链球菌病的应用研究

为解决罗非鱼链球菌感染难题,本研究在抗菌肽菌丝霉素分泌型丁酸梭菌制剂的基础上,对其进行了抑菌活性、稳定性和罗非鱼养殖应用研究。结果发现:表达产物菌丝霉素对常见致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌和猪链球菌均有较好的抑菌活性。选用米糠作为菌丝霉素分泌型丁酸梭菌的保护剂载体,此制剂可在常温保存一年。通过上述的应用基础试验,初步建立一套菌丝霉素分泌型丁酸梭菌制剂养殖应用方案,此方案可显著降低罗非鱼链球菌病发病率58.6%以上。本研究为丁酸梭菌制剂在防治罗非鱼链球菌病应用方面提供了参考,此制剂有望替代抗生素,促进罗非鱼养殖业的持续健康发展。

菌丝霉素NZ2114基因在毕赤酵母中表达及中试发酵研究

构建表达菌丝霉素NZ2114蛋白的真核重组表达质粒p Pic Zα-NZ2114,并转化毕赤酵母菌GS115,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得菌丝霉素NZ2114组成型表达菌株,并采用p H-溶氧监控策略进行工程菌毕赤酵母菌GS-115/p Pic Zα-NZ2114的50 L中试发酵研究。结果表明,本实验成功实现了菌丝霉素NZ2114基因在毕赤酵母GS115中的组成型表达p Pic Zα-NZ2114,Tricine-SDS-PAGE分析显示,在4.4 k Da处有明显的目的条带,工程菌经50 L发酵罐诱导培养96 h后取上清,对金黄色葡萄球菌CMCC26003有明显的抑制作用。菌丝霉素NZ2114基因在毕赤酵母中表达的方法在本研究中成功应用,中试研究为以后的规模化生产和应用奠定了基础。

菌丝霉素的发酵制备及其在饲料替抗中的潜在应用探究

研究旨在发酵制备菌丝霉素制剂,并探究其在饲料替抗中的潜在应用。试验对产抗菌肽菌丝霉素的重组毕赤酵母4Ple-61菌株发酵时间、甲醇诱导浓度和发酵体系pH值进行优化,分别利用真空冷冻干燥法和喷雾干燥法制备了含酵母细胞的菌丝霉素制剂。结果显示:甲醇诱导最佳浓度为1%,发酵pH值为5.5,诱导发酵120 h,此条件下4Ple-61菌株菌丝霉素具有较好的表达效果。与真空冷冻干燥法相比,喷雾干燥法的制备效果更好。将菌丝霉素制剂和鱼粉按照1∶1的质量比复配后,对金黄色葡萄球菌表现出明显的抑制效果。研究表明,菌丝霉素制剂在饲料替抗中具有一定应用潜力和良好开发前景。

抗菌肽菌丝霉素成膜剂制备及其应用

试验研究抗菌肽菌丝霉素成膜剂性能及其应用,运用单因素影响试验及L_9(3~4)正交试验选出最佳组合,通过透气性试验、黏附力试验及释药性试验对膜性能进行研究并应用于治疗奶牛乳房炎。结果表明:成膜剂的最佳组合(按体积比)为PVA甘油Tween-80CMC-Na=5%7%1.5%2.1%;正交试验分析为CMC-Na的试验影响最大,其次是Tween-80;该膜的透气率在7.45~9.05 g/(h·m^2)之间,黏附力在153.41~230.36 g之间,用药300 min之后该成膜剂释药量达到平衡。试验表明,抗菌肽成膜剂的制备工艺简单,膜性能良好,对奶牛乳房炎具有很好的治疗效果。

菌丝霉素的串联表达及其菌内抑菌活性分析

构建菌丝霉素(Plectasin,PT)的串联表达菌株,研究各串联体融合表达产物的菌内抑菌活性。根据大肠杆菌表达系统对密码子的偏爱性,人工合成优化后PT基因,构建表达质粒pGEX-PT/pe;并利用同尾酶法分别构建PT基因二聚体表达质粒pGEX-PT/pes2与PT基因三聚体表达质粒pGEX-PT/pes3;然后分别将各表达质粒转化入BL21(DE3)进行IPTG的诱导表达,对各表达蛋白进行SDS-PAGE、Western Blot分析,并测定各融合表达产物的菌內抑菌活性。测序结果表明,串联体扩增到产物大小分别为135、261和387bp的目的基因片段;SDS-PAGE分析各串联表达菌表达的融合蛋白相对分子质量分别约为30、35和40ku,其产量分别占细菌总蛋白的64.5%、26.4%和25.3%。Western Blot分析表明各表达蛋白均具有良好的免疫反应性;菌内抑菌结果显示,各融合表达产物均表现对DH5α的弱抑制作用,但随PT基因串联数的增加,融合表达产物的抑菌效果显著提高,且抑菌时间延长。各串联表达菌株的成功构建与其表达产物的宿主菌抑制作用,为菌丝霉素高效抑菌产品的开发奠定了基础。

菌丝霉素在酪丁酸梭菌中的表达研究

目的:构建菌丝霉素(Plectasin,Pt)的真核重组表达菌株,研究其在酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)中的表达和抑菌活性,提供一种高效,天然具有抑菌功能的新型食品添加剂和畜类养殖的抗菌制品。方法:先将启动子thl克隆到载体pMTL82151上,得到表达型质粒pMTL82151-thl,然后根据酪丁酸梭菌表达系统对密码子的偏爱性,人工合成优化后的Pt基因,再将产菌丝霉素基因Pt克隆到启动子thl的下游,构建表达质粒pMTL82151-Pt,并接合转化入酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum),通过甲砜霉素抗性筛选阳性重组子,PCR鉴定,SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得菌丝霉素组成型表达菌株,并进行工程菌酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)pMTL82151-Pt发酵表达研究。结果:thl基因与质粒pMTL82151连接,得到表达型质粒pMTL82151-thl,将产菌丝霉素基因Pt克隆到启动子thl的下游,成功构建表达质粒pMTL82151-Pt。实现了Pt基因在酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)中的组成型表达,SDS-PAGE分析显示,在4.4 kDa处有明显的目的条带。工程菌经发酵表达培养后取上清,对金黄色葡萄球菌ATCC25923的半抑制浓度(half-inhibitory concentration IC_(50))为12.74μg/mL。结论:本研究中成功将菌丝霉素在酪丁酸梭菌中表达,为以后大批量生产和推广菌丝霉素作为食品添加剂和肉食类畜牧养殖中抗生素替代品奠定了基础。

菌丝霉素抗菌肽高密度发酵生产及其特性研究

[目的]开发菌丝霉素抗菌肽,以替代抗生素在饲料生产中添加使用。[方法]以高产菌丝霉素毕赤酵母基因工程菌PPle-BC01为供试菌株,在15 L实验室发酵罐优化发酵工艺的基础上,通过50 L、5 t、60 t发酵罐高密度发酵工艺进一步优化放大试验,实现了60 t罐规模的稳定生产。经层析柱分离、纯化,得到相对纯度≥90%的纯品。纯品水解后的游离氨基酸样品,经PITC衍生化处理后,再经过HPLC检测及氨基酸组成摩尔百分比计算与氨基酸混合标准品比对,分析其氨基酸组成。纯品经多肽蛋白质相对分子质量分析测试,测得plectasin单同位素相对分子量。纯品经蛋白浓度、抗菌效价测定、比活计算以及产品抗菌效价测定,获得产品中plectasin含量,同时测试了解其产品特性。[结果]60 t发酵罐稳定3批次试生产发酵液菌体湿重峰值分别为43.34%、43.78%和43.78%,抗菌效价峰值分别为10566.99、10986.45和10788.56 U/mL;喷雾干燥产品收率分别为12.19%、12.30%和12.50%,抗菌效价分别为100672.10、103561.20和99765.50 U/g。3批次试生产产品中plectasin含量分别为2.26%、2.32%和2.24%。纯品经检测符合plectasin由40个氨基酸组成的多肽的理论氨基酸残基个数值,分子量为4.4407 kD。产品在95℃温度以下具有良好的热稳定性;pH 3.0~9.0具有良好的酸碱稳定性;在0.03%~0.30%猪胆盐浓度具有较好的胆盐耐受性;对胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K均具有良好的抗降解性。[结论]发酵终产品收率达10%,产品抗菌效价达8万U/g以上,产品中plectasin含量达2%以上,实现了60 t罐规模的产业化稳定生产。

菌丝霉素的高效表达、纯化及活性

将来自腐生子囊菌中的菌丝霉素成熟肽基因经大肠杆菌密码子优化后,克隆到pET32a(+)载体中,构建了含His-tag标签和TEV酶识别位点的菌丝霉素表达质粒pYG330,使含菌丝霉素的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式高效表达。建立了菌丝霉素的纯化路线,将融合蛋白进行TEV酶切后脱盐再进行亲和色谱分离,收集目的蛋白冻干浓缩,通过高效液相色谱进一步纯化获得纯度72%的目的多肽。纯化所得菌丝霉素对临床耐药金黄色葡萄球菌M-2和枯草芽孢杆菌有明显的抑菌活性。

基于易错PCR的菌丝霉素的定向进化

以菌丝霉素成熟肽经大肠杆菌密码子优化后的基因为基础,采用易错PCR技术,使用低保真的Taq酶,调整Mg2+浓度、添加Mn2+,改变PCR扩增程序,获得易错PCR产物。经克隆、转化后,挑取200株突变体进行测序鉴定,并进行抑菌活性筛选,筛得突变体M-1。基因比对结果显示,突变体M-1中有1个碱基发生突变,使得31位氨基酸由丙氨酸(Ala)变成精氨酸(Arg)。蛋白质分子空间结构模拟显示,突变位点位于蛋白质的?折叠上,靠近活性中心,氨基酸残基由疏水性变成极性,推测更有利于与lipidⅡ的特异性结合,增强抑菌活性。本研究还对突变体小肽M-1进行了分离纯化。抑菌活性试验表明,突变体小肽M-1的抑菌活性是菌丝霉素的2倍。