Polo样激酶1(PLK1)的敲低及其对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用

目的研究敲低Polo样激酶1(PLK1)后对宫颈癌HeLa细胞生长的作用。方法流式细胞术评测LAH4-L1载体对小干扰绿色荧光蛋白基因(siGFP)的递送效率;反转录PCR检测PLK1 mRNA水平,Western blot法检测PLK1蛋白水平;敲低PLK1水平后,采用CCK-8法检测HeLa细胞活性和生长抑制情况。结果 LAH4-L1-siPLK1纳米复合物可下调HeLa细胞PLK1约70%,并降低PLK1蛋白的表达,敲低PLK1后,可明显抑制HeLa细胞增殖。另外,LAH4-L1载体的基因递送效率能够稳定维持在较高水平。结论敲低HeLa细胞PLK1抑制癌细胞生长,LAH4-L1是一个较好的基因递送载体。

Plk1330／597位丝氨酸磷酸化突变体对胞质分裂的影响

目的:研究Plk的330/597位丝氨酸的模拟磷酸化突变体Plk1S330/597D和不能磷酸化突变体Plk1S330/597A的绿色荧光融合蛋白在HeLa细胞中的定位以及对有丝分裂的影响。方法:将野生型Plk1-GFP质粒、模拟磷酸化型突变体Plk1S330/597D-GFP质粒和不能磷酸化突变体Plk1S330/597A-GFP质粒分别转染HeLa细胞株,免疫荧光法检测突变体融合蛋白Plk1S330/597D-GFP和Plk1S330/597A-GFP的细胞定位的定位,West-ern blot法检测上述突变体融合蛋白的表达。通过有丝分裂期的细胞计数,流式细胞仪检测细胞周期,观察转染突变体后HeLa细胞的有丝分裂进程。结果:模拟磷酸化突变体Plk1S330/597D和不能磷酸化突变体Plk1S330/597A的融合蛋白能正确表达。突变体在细胞有丝分裂过程中均能正确定位于动点和中体,但不能磷酸化突变体Plk1S330/597A融合蛋白对HeLa细胞的有丝分裂有明显的抑制作用,使胞质分裂期的细胞数量较对照组明显增多,产生G2/M期阻滞(P<0.01),并造成染色体分离滞后的现象。结论:Plk1激酶自身的磷酸化状态对其有丝分裂期功能具有重要作用,其330和597位丝氨酸去磷酸化能抑制细胞的有丝分裂,使细胞周期发生G2/M期阻滞。

miR-10b调控PLK1蛋白对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的作用

目的探讨微小核糖核酸-10b(miR-10b)调控PLK1蛋白对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的作用。方法检测miR-10b鼻咽癌组织和细胞株中的表达水平,miR-10b和PLK1蛋白之间的关系; miR-10b对鼻咽癌细胞增殖和细胞周期影响; miR-10b对裸鼠移植瘤中PLK1表达的影响。结果鼻咽癌肿瘤组织中miR-10b的表达水平低于正常组织,且在CNE2细胞株中表达水平最低(P <0. 05);抑制miR-10b后PLK1蛋白的表达水平上调,增加miR-10b的表达可抑制鼻咽癌细胞的增殖(P <0. 05)。miR-10b-mimic组G1和M期细胞比例减少,S期和G2期的细胞比例增加; miR-10b组裸鼠肿瘤平均体积和平均质量均高于对照组(P <0. 05),miR-10b-mimic组裸鼠肿瘤中ki67和PCNA表达水平较强。结论 miR-10b靶向PLK1对鼻咽癌细胞增殖行为有一定的抑制作用,miR-10b在人鼻咽癌的发生发展过程中扮演着重要角色。

保罗样激酶1和p53在食管鳞癌中的表达及临床意义

目的:探讨保罗样激酶1(PLK1)和p53蛋白在食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组织化学法分别检测87例食管鳞状细胞癌、53例癌旁组织及42例正常食管黏膜组织中PLK1及p53蛋白的表达,并分析两者的表达水平与临床病理因素的关系。采用2χ检验进行统计学分析。结果:PLK1蛋白在食管鳞状细胞癌、癌旁组织及正常黏膜组织中的阳性表达率分别为57.5%、50.9%和26.2%;p53蛋白的阳性表达率分别为48.3%、52.8%和23.8%。鳞癌组织PLK1、p53阳性表达率与正常黏膜组比较差异均有统计学意义(2χ分别为11.119和7.047,P<0.05),癌旁组织PLK1、p53阳性表达率与正常黏膜组织差异均有统计学意义(2χ分别为5.982和8.223,P<0.05),两者在鳞癌组织与癌旁组织的表达差异均无统计学意义(2χ分别为0.567和0.273,P>0.05)。食管鳞癌组织中PLK1和p53的蛋白表达与淋巴结转移及TNM分期密切相关(P<0.05),而PLK1的蛋白表达还与肿瘤浸润深度有关(P<0.01)。两者在食管鳞状细胞癌组织中的表达呈负相关(r=-0.286,P<0.01)。结论:PLK1及p53的蛋白表达与食管鳞状细胞癌发生发展密切相关,联合检测PLK1及p53蛋白对食管鳞癌的预后判断具有重要意义。

冬凌草甲素上调PLK1对Jurkat细胞细胞周期的影响

目的·探索冬凌草甲素对Jurkat细胞增殖的抑制作用及其机制。方法·采用CCK-8法、流式细胞术、瑞士吉姆萨染色、蛋白质印迹法,检测冬凌草甲素处理后Jurkat细胞的增殖情况、细胞周期、凋亡情况及有丝分裂相关蛋白激酶表达情况。蛋白质印迹法检测冬凌草甲素处理后,Jurkat细胞中Polo样蛋白激酶1(Polo-like kinase 1,PLK1)下游蛋白的磷酸化水平。通过计算机模拟、免疫沉淀、蛋白质印迹法、细胞热力学迁移实验方法研究冬凌草甲素与PLK1的结合方式及结合位点。组间比较采用t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。结果·冬凌草甲素通过上调PLK1蛋白含量并促进其激酶活性,从而诱导Jurkat细胞发生G2/M期阻滞;冬凌草甲素可与PLK1蛋白直接结合抑制其通过泛素蛋白酶体途径降解;如PLK1蛋白的Cys67或Cys133氨基酸残基发生突变则抑制冬凌草甲素与其直接结合,且抑制冬凌草甲素对PLK1蛋白的稳定作用。结论·冬凌草甲素通过直接结合PLK1蛋白抑制其泛素化修饰及降解,促进其活性,诱导Jurkat细胞发生G2/M期阻滞;PLK1蛋白的Cys67和Cys133位点是蛋白与冬凌草甲素结合的关键位点。

新型2-喹诺酮类Polo样激酶1抑制剂的设计合成及分子对接研究

目的:设计合成新型2-喹诺酮类Polo样激酶1(Plk1)抑制剂。方法:以Plk1抑制剂ON 01910为先导化合物,利用生物电子等排原理设计一系列2-喹诺酮类衍生物,用Autodock软件将该类化合物与Plk1进行分子对接和虚拟筛选,计算结合自由能;以取代的氯(溴)苄为起始原料,先后经巯基乙酸取代、双氧水氧化、与(对甲氧基)苯胺酰化,再经环合、水解制得目标化合物。结果:设计的化合物大多数与Plk1的结合自由能均比ON 01910的低,结合强度高、稳定性好;合成了16个2-喹诺酮类衍生物,产物结构经1H-NMR确证。结论:所得化合物中有15个为新化合物,化合物的结构设计科学合理,虚拟筛选结果良好,为后续实体筛选和化合物结构优化提供了理论依据和参考。

新型PLK1抑制剂的设计合成及抗肿瘤活性研究

目的 设计并合成一系列新型PLK1抑制剂,测试其对PLK1激酶的体外抑制活性,初步探究其构效关系,为后续相关研究提供参考。方法 以临床药物伏拉塞替为先导化合物,通过骨架跃迁和生物电子等排等方法,设计并合成新型PLK1抑制剂,采用均相时间分辨荧光法测定目标化合物对PLK1激酶的体外抑制活性。结果与结论共合成了14个目标化合物,其结构经MS、1H-NMR谱确证。活性结果表明化合物5a、5e、5i、5j和9b具有较强的PLK1抑制活性,IC50值分别为9.01、3.11、6.47、2.65、7.41 nmol·L-1,均优于阳性对照药伏拉塞替(IC50值为9.59 nmol·L-1),其中化合物5e和5j可作为优选化合物进行深入研究。

14-3-3ε调节小鼠受精卵纺锤体组装

目的:研究14-3-3ε蛋白调节小鼠受精卵纺锤体组装的作用。方法:采用间接免疫荧光实验检测1-细胞期受精卵14-3-3ε和α-微管蛋白的亚细胞定位;利用显微注射方法将14-3-3εsi RNA注射入1-细胞期受精卵,观察小鼠受精卵纺锤体形态及检测Polo样激酶1(Plk1)的活性。结果:14-3-3ε和α-微管蛋白在G1期、S期和G2期卵中主要共定位于细胞质,M期卵14-3-3ε主要位于细胞质皮质。小鼠受精卵注射14-3-3εsi RNA后导致异常形态纺锤体形成及Plk1活性下降。结论:14-3-3ε蛋白在调节小鼠受精卵纺锤体组装中发挥重要作用。