PLZF的克隆及其对犏牛未分化精原细胞的增殖作用

【目的】犏牛作为牦牛与黄牛的种间杂交产物,具有优良的生产性能,但其杂种优势的进一步应用却受限于犏牛雄性不育。通过克隆犏牛PLZF,明确其在犏牛和牦牛睾丸组织和未分化精原细胞中的差异表达,并进一步揭示过表达该基因对犏牛未分化精原细胞活性的影响。为阐明犏牛生精停滞的作用机制提供理论基础。【方法】以24月龄公麦洼牦牛和F1代公犏牛为实验动物,通过RT-PCR法克隆得到了犏牛PLZF的CDS序列,并进行了生物信息学分析;通过RT-qPCR法分析PLZF在犏牛和牦牛睾丸组织中的差异表达;采用同源重组的方法构建了PLZF的表达载体,并利用RT-qPCR检测了PLZF过表达效率及其下游靶基因的表达;通过PDT、CCK-8、EdU和免疫荧光检测了过表达PLZF对犏牛未分化精原细胞增殖活性的影响。【结果】克隆获得了犏牛PLZF的CDS区,并通过生物信息学分析发现该基因编码的蛋白序列不包含跨膜结构域和信号肽序列,其三级结构以α螺旋和无规卷曲为主。系统进化树分析表明犏牛PLZF与黄牛PLZF的亲缘关系更近。三级结构预测发现,虽然犏牛、牦牛和黄牛的PLZF蛋白三级结构高度相似,但牦牛PLZF蛋白在531—540位氨基酸处与犏牛和黄牛有较大差异。RT-qPCR发现,PLZF在犏牛睾丸组织和未分化精原细胞中的表达均显著低于牦牛(P<0.05),而在犏牛未分化精原细胞中过表达PLZF后,该基因的表达上调了13.8倍(P<0.01),且能显著增加犏牛未分化精原细胞的增殖活性(P<0.05),表明PLZF表达下调影响了犏牛未分化精原细胞增殖活性。此外,过表达PLZF后,犏牛未分化精原细胞中与增殖相关的基因(Etv5、Bcl6b、Pcna和c-fos)全部显著上调(P<0.05),与分化相关的基因(Stra8、Kit、Dmrt1和Sohlh2)全部显著下调(P<0.05),表明PLZF通过上调增殖相关基因、下调分化相关基因的表达促进犏牛未分化精原细胞增殖。【结论】PLZF在犏牛未分化精原细胞中表达异常降低了犏牛未分化精原细胞增殖活性,导致其数量减少,影响了犏牛的精子发生。本试验为进一步阐明犏牛生精停滞的作用机制提供了理论基础,并为解决犏牛雄性不育问题提供了新的思路。

活动性结核病人PBMCs中转录因子PLZF的表达降低与iNKT细胞的减少相关

目的:比较活动性结核病人和健康人外周血单个核细胞(PBMCs)中转录因子PLZF(Promyelocytic leukemiazinc finger)的表达和iNKT细胞含量的差异,研究活动性结核病人PBMCs中PLZF的表达与iNKT细胞含量的相关性。方法:采集活动性结核病人和健康人新鲜的抗凝血,淋巴细胞分离液分离PBMCs。每个样本的PBMCs分两份,一份细胞用Trizol法提取总RNA,荧光定量PCR检测PLZF mRNA的相对表达量;另一份细胞用特异性抗体标记iNKT细胞,流式细胞仪检测iNKT细胞的含量。统计学软件分析两组样本PLZF的表达和iNKT细胞含量的差异,以及PLZF的表达与iNKT细胞含量的相关性。结果:活动性结核病人PMBCs中PLZF的表达和iNKT细胞含量均显著低于健康对照(P值分别为0.010 2和0.001 2),PLZF的表达与iNKT细胞的含量成正相关(r=0.480 4,P=0.027 5)。结论:活动性结核病人PLZF的表达降低与iNKT细胞百分含量的减少相关。

氧化砷和维甲酸对PLZF-RARa阳性U937细胞的作用

目的:研究氧化砷(As2O3)和全反式维甲酸(AT-RA)对PLZF-RARα阳性细胞的作用。方法:稳定转染PLZF-RARα基因的U937细胞(U937/PLZF)经As2O3、ATRA处理后,Wright-Giemsa染色观察细胞形态,MTT法检测细胞生长增殖状态,流式细胞术(FCM)检测细胞周期和细胞表面分化抗原CD11b、CD64、CD14等的表达变化,荧光免疫细胞化学染色检测融合蛋白表达,细胞化学染色和硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验观察细胞功能分化情况。结果:U937/PLZF细胞在去除四环素条件培养后,PLZF-RARα表达明显增加。As2O3(0.5μmol/L)联合ATRA(1μmol/L)使U937/PLZF细胞核质比缩小,核仁减少但未消失;生长增殖受抑;S期细胞减少;CD11b表达增高;PLZF-RARα蛋白表达减弱,分布以胞核弥漫细小颗粒为主。细胞化学染色和NBT反应变化不明显。结论:0.5μmol/L As2O3联合1μmol/L ATRA可使PLZF-RARα阳性U937细胞产生轻微的形态学分化趋势,尚不足以引起其发生功能分化。

PLZF-RARα/RARα-PLZF双阳性转基因小鼠发生白血病模型研究

本研究目的是从生物整体水平上研究PLZFRARα/RARαPLZF双融合基因的表达在急性早幼粒细胞白血病(APL)发病中的作用及发病机制。通过交配建立PLZFRARα/RARαPLZF双阳性转基因小鼠(TM)模型;采用PCR、RTPCR方法检测融合基因的整合和表达;应用血象、骨髓象、病理和流式细胞术等对疾病表型进行检测分析;并观察全反式维甲酸(ATRA)或ATRA与tricostatinA(TSA)联合用药对PLZFRARα/RARαPLZF双阳性转基因小鼠骨髓细胞的作用。结果表明,在近18个月的时间观察到51只PLZFRARα/RARαPLZF双阳性转基因小鼠中有5只小鼠发病,发病率约10%,与我所同期的仅PLZFRARα转基因阳性小鼠11.3%的发病率相似。发病时间均在6月龄以后,与PLZFRARα转基因阳性发病小鼠相比示提前,但疾病表型不同,2只(40%)为急性早幼粒细胞白血病(APL)改变,3只(60%)为慢性粒细胞白血病(CML)改变。ATRA处理组的骨髓细胞形态无改变,而ATRA+TSA组骨髓原始细胞核浆比例降低,染色质固缩,呈现粒细胞分化趋势。结论PLZFRARα/RARαPLZFTM小鼠发病存在异质性,其骨髓细胞对ATRA无反应,而ATRA与TSA联合用药可诱导骨髓原始早幼粒细胞分化。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A联合全反式维甲酸诱导PLZF-RARα阳性U937细胞分化

目的:研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(TSA)和全反式维甲酸(ATRA)对PLZF-RARα阳性细胞的作用.方法:稳定转染PLZF-RARα基因的U937细胞(U937/PLZF)经TSA,ATRA作用一段时间后,Wright-Giemsa染色观察细胞形态,MTT法检测细胞生长和增殖状态,流式细胞仪检测细胞周期和细胞表面分化抗原CD11b,CD64,CD14等的表达,荧光免疫细胞化学染色检测融合蛋白表达,细胞化学染色和硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验观察细胞功能分化情况.结果:U937/PLZF细胞在去除四环素条件培养后,PLZF-RARα表达明显增加.TSA(30μg/L)联合ATRA(1μmol/L)使U937/PLZF细胞核质比缩小,生长增殖受抑,S期细胞减少,CD11b表达增高,PLZF-RARα蛋白表达减弱,分布以胞核弥漫细小颗粒为主,细胞功能上的分化可能尚不成熟.结论:组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA联合ATRA可使U937/PLZF细胞发生部分分化.

曲古菌素A和ATRA合用对PLZF-RARα转基因阳性发病鼠骨髓细胞的诱导分化作用

目的:研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(trichostatin A,TSA)和ATRA对PLZF-RARα转基因发病鼠骨髓细胞的作用.方法:分子克隆技术构建hCG-PLZF-RARα转基因构件.显微注射建立仅在髓系细胞中表达PLZF-RARα的转基因小鼠模型.DNA-PCR,Southern blot,RT-PCR,免疫荧光,血象,骨髓象,脾细胞形态,病理等检测分析基因整合表达及发病情况.取PLZF-RARα转基因发病鼠骨髓细胞体外培养,经TSA和ATRA作用一段时间后,Wright-Giemsa染色观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞周期、细胞表面分化抗原CD11b和CD117等的表达,荧光免疫细胞化学染色检测融合蛋白表达,硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验观察细胞功能分化情况.结果:TSA(30μg/L)联合ATRA(1μmol/L)使发病鼠骨髓细胞核质比缩小,幼稚细胞比例减少,细胞生长增殖受抑,S期细胞减少,PLZF蛋白的表达呈局部聚集的趋势,但NBF还原试验变化尚不明显.结论:组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA联合ATRA可使PLZF-RARα转基因发病鼠骨髓细胞发生部分分化.

PLZF与哺乳动物雄性生殖干细胞的发育分化

早幼粒细胞白血病锌指蛋白(promyelocytic leukemia zinc finger,PLZF),也被称为ZBTB16(zinc finger and BTB domain containing 16,ZBTB16)或锌指蛋白145(zinc finger protein 145,ZFP145),是我国学者发现与人类疾病相关的蛋白质.人类PLZF的是由673个氨基酸残基组成的转录抑制因子,属于蛋白质超家族.该超家族以N端的BTB/POZ(bric-à-brac,tramtrack,brad complex(BTB)/poxvirus zinc finger(POZ)domain)结构为特征.PLZF蛋白的BTB/POZ结构与个体发育、胚胎发生、染色体的重构等事件相关.近年发现,PLZF在哺乳动物雄性生殖干细胞(male germline stem cells,mGSCs)发育分化过程中也发挥重要作用.探讨PLZF的生物学功能和作用机制,将有助于理解其在mGSCs发育过程中的重要作用.本文就PLZF在维持mGSCs自我更新和在发育分化调控中的作用给予综述.

热应激对小鼠睾丸组织和精原干细胞中Sirt1、PLZF和Oct4基因表达的影响

高温应激会损伤哺乳动物生殖系统,造成生殖器官组织形态和基因表达的改变,导致精子发生异常。成年动物睾丸中精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)具有不断增殖和自我更新的能力,是精子发生的基础,而 PLZF (Promyelocytic Leukemia Zinc Finger)和 Oct4 (octamer-binding transcription factor)证实均是维持精原干细胞自我更新和增殖的重要基因。在精原干细胞中过表达 Sirt1 (Sirtuin type 1)基因能上调 PLZF和Oct4 的表达。此试验以雄性小鼠为研究对象,利用组织切片免疫染色、精原干细胞体外培养、细胞免疫荧光染色和荧光定量PCR等技术,检测热应激处理的活体小鼠睾丸组织和体外培养SSCs中的 Sirt1、PLZF和Oct4 基因表达变化。结果发现,所有热应激组样品中 Sirt1、PLZF和Oct4 基因的核酸、蛋白水平表达量均下调,小鼠睾丸组织切片中热应激组的 Sirt1、PLZF和Oct4 基因在曲细精管基底膜附近细胞群(含精原干细胞)中的特异性染色点减少,定量PCR检测证实该三个基因的相对表达量在热应激组中均显著下调( P <0.01);体外培养SSCs中热应激组的 Sirt1、PLZF和Oct4 基因染色阳性细胞数目减少,定量PCR检测证实该三个基因的相对表达量在热应激组细胞中均显著下调( P <0.01)。以上结果为进一步研究 Sirt1 在精原干细胞热应激过程中的功能奠定基础。

大鼠pEGFP-PLZF真核载体的构建及在精原细胞中的表达

目的:构建真核表达重组质粒pEGFP-N1-PLZF,并了解其在大鼠精原细胞中的融合蛋白表达情况。方法:参考分子克隆技术,采用RT-PCR的方法从大鼠睾丸组织中扩增早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF),将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,并用双酶切、测序进行鉴定;将重组质粒用脂质体转染的方法导入精原细胞中,观察有无荧光的表达及用Western blot检测蛋白表达情况。结果:实验从大鼠睾丸组织中获取了编码plzf基因的全序列cDNA,产生了2 kb的目的插入片段,与pEGFP-N1载体连接后经酶切电泳鉴定及DNA测序证实序列正确;重组质粒转染精原细胞24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,并用Western blot检测到106 kD目的蛋白的表达。结论:新构建的重组质粒pEGFP-N1-PLZF通过鉴定,结构正确。转染到精原细胞后能在其中表达,发挥功能,为后续研究奠定了基础,对研究PLZF调控精原细胞增殖和分化机制具有重要的意义。

PLZF结构功能的研究进展

PL ZF发现于少见的 t(11;17)导致的早幼粒细胞白血病 ,形成的 PL ZF- RARa和 RARa- PL ZF导致发生早幼粒细胞白血病。 PL ZF基因敲除小鼠表现为后肢骨骼的形态缺陷及部分前肢骨骼缺陷 ,PL ZF还与神经发育有密切的关系。这些表明 PL ZF在胚胎发育中起十分重要的作用。随着研究的逐渐深入 ,发现 PL ZF与许多重要的基因都有相互作用 ,例如 HOX、PML、BCL - 6、GATA家族及细胞周期调控基因等 ,这些基因与发育及肿瘤的发生息息相关。因此围绕 PL ZF基因的研究将有助于阐明机体的发育。

PLZF调控小鼠早期T细胞发育和自我更新的功能

目的:研究PLZF调控小鼠早期T细胞发育与自我更新的功能,以及PLZF对胸腺细胞发育和自我更新的影响。方法:利用新生小鼠进行胸腺移植,以Rag2/γc−/−小鼠为受体。首先比较PLZF−/−与野生型(PLZF+/+)小鼠胸腺细胞总数的差异,再通过流式细胞术和细胞分选,筛选小鼠的骨髓造血干细胞和胸腺的DN2a细胞以及PLZF−/−小鼠的早期T细胞系前体(ETP),以及PLZF−/−或野生型小鼠在新生小鼠胸腺移植模型的移植物DN1细胞中的表达情况。结果:PLZF−/−小鼠的胸腺细胞总数和早期T细胞系前体数目与野生型小鼠相比显著下降,并且细胞总数的减少不是由细胞内源性引起的。通过研究PLZFEGFP报告基因小鼠和新生小鼠胸腺的肾移植模型,发现PLZF在Rag2/γc−/−受体小鼠胸腺移植物的DN1(Lineage−CD44+CD25−)细胞中高表达,且供体细胞的PLZF缺失会显著影响来源胸腺移植物的DN1细胞的比例。结论:PLZF可能在T细胞的正常增殖发育过程中不是必需的,但很可能参与维持早期T细胞系前体的自我更新。

伴PLZF/RARα融合基因阳性APL一例

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)是急性髓系白血病(AML)的一种特殊类型,为目前唯一可以不通过化疗治愈的恶性血液病类型。APL具有特异的融合基因、染色体核型改变,即t(15,17)(q22;q12~21),其特异的遗传学特征导致15号染色体上的早幼粒细胞白血病(promyelocytic leukemia,PML)基因和17号染色体上的维甲酸受体α(retinoic acid receptorα,RARα)基因融合形成PML-RARα融合基因。

伴PLZF/RARα阳性急性早幼粒细胞白血病的治疗:附1例报告并文献复习

目的:提高对伴PLZF/RARα融合基因阳性的急性早幼粒细胞白血病(APL)诊断和治疗的认识。方法:报道1例伴PLZF/RARα融合基因阳性APL的诊断、治疗经过及随访情况。结果:患者经骨髓形态学、组织化学、免疫分型、染色体、融合基因等检查确诊为APL伴PLZF/RARα融合基因阳性,予以三氧化二砷(ATO)联合化疗达到完全缓解(CR)后,继续予以ATO联合化疗强化巩固治疗。随访11个月,患者仍处于CR1期。结论:伴PLZF/RARα融合基因阳性APL可采用ATO联合化疗诱导、巩固治疗,延长患者生存时间。

PLZF基因大致结构的研究

报道了与急性早幼粒细胞白血病(APL)t(11;17)变异型易位有关的PLZF基因结构及表达.该基因至少长130kb,由7个外显子和6个内含子组成.发现外显子2中存在着替换剪接现象,且剪接供体信号为不典型的GA.PLZF基因的断裂点主要丛集于内含子3,该基因的表达具有组织特异性.

大鼠pEGFP-N1-PLZF真核表达载体的构建和意义

目的构建真核表达载体pEGFP-N1-PLZF,为基因水平研究早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF)在精原干细胞增殖和分化中的调控机制提供理论参考。方法参考分子克隆技术,采用RT-PCR的方法从大鼠睾丸组织中扩增PLZF,将该基因连接克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体pEGFP-N1上,以构建重组质粒pEGFP-N1-PLZF。结果实验从大鼠睾丸组织中提取总RNA,以RT-PCR方法获取编码PLZF基因的全序列cDNA。构建PLZF的cDNA真核表达质粒时将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在PLZF基因,并经酶切后DNA电泳鉴定及DNA测序证实结果。结论构建重组质粒pEGFP-N1-PLZF成功,实验中将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在PLZF基因的3’端。提高PLZF在真核细胞中的表达,而且不影响其目的蛋白的结构和功能,对研究PLZF调控精原干细胞增殖和分化机制具有重要的意义。

PLZF－RARα──急性早幼粒细胞白血病一个新的融合基因

对一例变异型易位ｔ（１１；１７）（ｑ２３；ｑ２１）的急性早幼粒细胞白血病患者进行分子生物学研究，发现一个新的含九个锌指结构的基因——早幼粒白血病锌指基因（ＰＬＺＦ）。该基因位于１１ｑ２３，在ｔ（１１；１７）中与维甲酸受体α基因发生了重排，形成位于ｄｅｒ（１１）和ｄｅｒ（１７）上的两个融合转录单位。ｔ（１１；１７）中ＲＡＲα基因的断裂点亦位于Ａ和Ｂ区之间，其Ｂ－Ｆ区域与ＰＬＺＦ的激活区以及第１，２两个锌指融合，形成ＰＬＺＦ－ＲＡＲα。而ＲＡＲα的Ａ区则与ＰＬＺＦ中的另７个锌指形成ＲＡＲα－ＰＬＺＦ融合基因。阐明了这两个融合基因的生物学特性，并与ｔ（１５；１７）中形成的ＰＭＬ－ＲＡＲα及ＲＡＲα－ＰＭＬ相比较，对于认识不同染色体易位在急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）发病机制中所起的作用具有重要意义。

急性早幼粒细胞白血病中 PLZF/RARα 对野生型 RARα 显性负作用的研究

目的：了解急性早幼粒细胞白血病（ＡＰＬ）的早幼粒细胞白血病锌指基因（ＰＬＺＦ）和１７号染色体上的ＲＡＲα基因与ＡＰＬ发生的关系。方法：应用ＰＣＲ克隆方法，缺失ＰＬＺＦ／ＲＡＲα的ＰＬＺＦ不同区域，构建了８个ＰＬＺＦ／ＲＡＲα的突变体进行细胞转染。结果和结论：证实了ＰＬＺＦ／ＲＡＲα对野生型ＲＡＲα有明显的显性负作用，而ＰＯＺ区域（即氨基酸１～１２０）对ＰＬＺＦ／ＲＡＲα的显性负作用的形成是至关重要的，２个锌指结构可能通过与ＰＯＺ区域的空间构型的相互作用而在显性负作用中起一定作用。

重组PLZF蛋白锌指结构域的表达、提纯和活性分析

PLZF(promyelocytic leukaemia zinc finger protein)是一种重要的转录抑制因子,它由位于N端的BTB结构域和C端的锌指结构域构成。鉴于目前对于锌指结构域的立体结构还不是十分清楚,对其进行了高效表达和提纯。为了表达PLZF蛋白的锌指结构域,在其编码序列的5'端加上起始密码ATG后插入到表达载体PET-11a的多克隆位点。构建好的表达质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌内并用IPTG诱导表达,发现重组蛋白主要以不溶性的包涵体形式在胞内表达。用含有SDS变性剂的缓冲液溶解包涵体后,采用凝胶过滤方法将重组蛋白纯化到纯度达96%以上。对纯化后的蛋白质用反透析的方法进行复性,然后用DNA结合实验进行活性分析,发现复性后的蛋白质具有特异的DNA结合活性,这为进一步研究PLZF蛋白锌指结构域的立体结构打下了重要基础。