泛素连接酶E4B介导POLDIP2的泛素化及其降解

目的旨在细胞外和HEK293细胞中鉴定聚合酶δ相互作用蛋白2(POLDIP2)是否为泛素连接酶E4B的底物,并探究E4B能否介导POLDIP2经由26S蛋白酶体降解。方法利用BL21表达并纯化POLDIP2蛋白,设置体外E1-E2-E3泛素传递反应,通过western blot检测POLDIP2的泛素化;同时,构建pcDNA-Flag-POLDIP2重组质粒并转染进HEK293细胞、E4B敲减稳转株(shE4B)、E4B过表达细胞株(E4B OE)中,通过免疫共沉淀检测E4B表达量的变化是否影响POLDIP2的泛素化水平;其次,进一步通过CHX Chase实验,以及在HEK293细胞中转染依次增量的pLVX-E4B质粒,通过western blot检测POLDIP2蛋白水平的变化。结论胞外泛素化反应和胞内泛素化鉴定均证实泛素连接酶E4B可以将POLDIP2泛素化,并且能够介导其通过26S蛋白酶体进行降解。

Poldip2通过调控黏附分子表达影响炎症所致的脑内皮细胞损伤

目的探讨Poldip2在炎症所致的脑内皮细胞损伤中的作用及机制。方法通过细胞转染建立沉默Poldip2的脑微血管内皮细胞系bEnd.3,ELISA方法检测上清液中炎症因子IL-1β和TNF-α的水平;Western blot方法检测沉默Poldip2对血脑屏障相关蛋白ZO-1和Claudin-5的表达以及黏附相关蛋白ICAM-1及VCAM-1的影响。结果Poldip2沉默可以减轻LPS诱导的脑内皮细胞炎症因子IL-1β和TNF-α的分泌,恢复血脑屏障相关蛋白ZO-1和Claudin-5的表达,减少白细胞黏附分子ICAM-1及VCAM-1的表达(P<0.05)。结论Poldip2可以通过促进白细胞黏附相关蛋白的表达,造成脑内皮细胞损伤,影响血脑屏障的完整性。

KKAy小鼠聚合酶delta作用蛋白2缺乏导致血糖异常的研究

目的通过对2型糖尿病模型鼠KKAy中注入聚合酶delta作用蛋白2(Poldip2)腺病毒,探讨其对于胰岛素信号通路和小鼠肝脏的糖代谢的调节作用。方法利用特殊的糖尿病模型鼠即KKAy小鼠,将其随机分为磷酸盐缓冲液组(PBS组)、绿色荧光蛋白组(GFP组)和Poldip2组;C57BL/6J为正常对照组。利用Western blot检测小鼠肝脏的Poldip2的表达以及胰岛素信号通路中蛋白的表达水平,同时采用RT-PCR检测磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)的mRNA表达的水平。结果通过对胰岛素信号通路相关蛋白检测,Poldip2组可降低10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源(PTEN)表达,从而激活蛋白激酶B(Akt)促进胰岛素通路的传递,进而降低G6Pase、PEPCK表达来调节血糖。结论 Poldip2改善2型糖尿病鼠的糖代谢的机制可能是通过升高Poldip2的表达,激活NADPH氧化酶4(NOX4)产生过氧化物(H2O2),抑制了PTEN从而激活Akt活性,改善了胰岛素信号通路及糖代谢的紊乱。