板蓝根体外抗单纯疱疹病毒Ⅰ型作用

目的探讨板蓝根5个化学部位体外抗单纯疱疹病毒型(HSV-Ⅰ)的活性及作用机制。方法利用Hep-2细胞体外培养系统,通过观察细胞病变效应(CPE)、噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性,测定板蓝根不同化学部位抑制HSV-Ⅰ对Hep-2细胞感染的作用;以治疗指数(TI)为评价指标,比较各部位抗病毒活性强弱。结果板蓝根各部位均有抑制HSV-Ⅰ生物合成作用,其中部位活性最强,TI为8.2;部位对HSV-Ⅰ有直接灭活作用;各部位均不能阻止HSV-Ⅰ侵入细胞。结论板蓝根在体外主要通过抑制生物合成而发挥抗HSV-Ⅰ作用。

大青叶抗单纯疱疹病毒Ⅰ型的活性研究

目的:评价大青叶不同化学部位抗单纯疱疹病毒Ⅰ型的活性.方法:利用Hep-2细胞体外培养系统,通过噻唑蓝(MTT)比色法和观察细胞病变效应(CPE),以治疗指数(TI)为评价指标,评价大青叶不同化学部位体外抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)对Hep-2细胞的感染作用;并通过改变加药方式,初步探讨抗病毒机制.选择体外抗病毒活性较强的部位,观察其对HSV-Ⅰ脑炎小鼠的保护作用,以综合评价其抗病毒活性.结果:大青叶Ⅱ～Ⅴ部位对HSV-Ⅰ有直接灭活作用,各部位均不能阻止HSV-Ⅰ侵入细胞,除Ⅲ,Ⅴ部位外,其余部位均有抑制HSV-Ⅰ生物合成作用;Ⅳ部位能显著降低HSV-Ⅰ脑炎小鼠死亡率.结论:大青叶Ⅳ部位具有较强的体内外抗HSV-Ⅰ病毒活性.

Ⅰ型鸭肝炎病毒逆转录套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)A66株的RNA聚合酶基因序列,设计合成了2对引物,建立了适合DHV-Ⅰ快速检测的逆转录套式PCR方法(RT-nested-PCR),采用该方法对DHV-ⅠA66弱毒株和R85952强毒株进行了检测。结果显示,均能扩增到304 bp的条带,而正常鸭胚、健康鸭肝组织、鸭瘟病毒、鹅细小病毒、禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性腔上囊病病毒、减蛋综合征病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌和鸭源多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。表明,所建立的逆转录套式PCR方法可用于鸭病毒性肝炎(DVH)的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等。

鸭肝炎病毒Ⅰ型VP3基因的克隆及原核表达

参照鸭肝炎病毒Ⅰ型(DHV-Ⅰ)的基因组序列设计并合成了1对引物。通过RT-PCR方法扩增获得了DHV-Ⅰ病毒161/79/V结构蛋白VP3基因,并将VP3基因片段插入pGEX-6p-1表达载体,转化E.coli Rosetta-gami(DE3)pLysS。SDS-PAGE分析表明,经用0.1mmol/LIPTG于16℃诱导表达后,菌体裂解产物有特异的、分子质量约52ku的目的蛋白条带。Western-blotting检测表明,表达产物与DHV-Ⅰ阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。

PRRSV和PCV-2以及PRV多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因、猪圆环病毒2型(PCV-2)rep蛋白基因和猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的核苷酸序列分别设计了3对特异性引物,成功建立了同时检测PRRSV、PCV-2、PRV的多重SYBR Green-Ⅰ实时荧光PCR方法。敏感性试验结果显示,PRRSV、PCV-2的敏感性可达250拷贝/μL,PRV的敏感性可达500拷贝/μL。表明,该方法具有较好的特异性、重复性和敏感性,可以用于PRRSV、PCV-2和PRV的快速检测。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒鉴别RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中公布的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和实验室分离到的Ⅰ型鸭病毒性肝炎ZJ株、Ⅰ型鸭病毒性肝炎R株所测序列（GenBank登录号分别为EU841005和EF585200）以及新型鸭肝炎病毒全基因组序列，应用PrimerPrimier5．0软件，在序列保守区域分别设计了2对鉴别引物，成功建立了Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒的鉴别RT—PCR检测方法。结果表明：该方法能从Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒中扩增到与预期相符的471bp条带，从广东佛山分离到的新型鸭肝炎病毒FS株中扩增到705bp的条带，设计的2对引物能够特异性地检测出Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒，特异性好；分别能够检测出模板含量为0．8ng／μL和1．0ng／μL的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒。因此，该方法可用于Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒和新型鸭病毒性肝炎临床样品的鉴别诊断和分子流行病学调查。

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP3基因的克隆与原核表达

根据GenBank上登录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)基因组序列,设计一对特异性引物。通过RT-PCR的方法扩增DHV-Ⅰ(A66株)VP3基因并将其5′端起始处稀有密码子同义突变。用限制性内切酶BamHⅠ/SalⅠ消化VP3基因片段和表达载体pGEX-6p-1后构建重组表达质粒pGEX-VP3,转化E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析表明,VP3基因在大肠埃希菌中大量表达,表达产物的分子质量约为52 ku。Western blot检测表明,表达产物能与DHV-Ⅰ阳性血清发生反应,具有反应原性。

牛膝多糖硫酸酯抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的实验研究

以细胞培养技术对牛膝多糖（Ａｃｈｙｒａｎｔｈｅｓｂｉｄｅｎｔａｔａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，Ａｂｐｓ）硫酸酯抗Ⅰ型单纯疱疹病毒药效的实验进行研究。受试药物Ａｂｐｓ硫酸酯（Ａ－５、Ａ－６、Ｂ－３、Ｂ－４、Ｂ－５、Ｃ－６、Ｃ－７、Ｃ－８）和对照药物环胞苷（ＣＣ）、亚膦酰乙酸（ＰＡＡ）按照综合药效指数评价时，排列顺序为Ａ－６（２．１７）＞ＣＣ（２．１１）＞ＰＡＡ（２．０４）＞Ｂ－３（２．０２）＞Ｂ－５（１．９０）＞Ａ－５（１．６０）＞Ｃ－８（１．３８）＞Ｃ－７（１．３２）＞Ｂ－４（０．８４）＞Ｃ－６（０．８０）。由此可见，８种受试的化学合成药牛膝多糖硫酸酯中Ａ－６为抗Ⅰ型单纯疱疹病毒效果较佳新药，本品优于环胞苷和亚膦酰乙酸。

新入伍人群单纯疱疹病毒Ⅰ型血清抗体检测分析

目的了解入伍新兵人群中单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-Ⅰ)感染IgG抗体的流行分布,为预防提供科学依据。方法利用酶联免疫吸附试验(ELISA)对本区近4年来自8个省市的360名入伍新兵血清进行HSV-ⅠIgG抗体检测。结果2002,2004,2006,2008年各年入伍新兵血清HSV-ⅠIgG抗体阳性率呈下降趋势,分别为90.00%,86.67%,85.55%,84.44%,平均86.67%;地区间差别明显,广西(96.00%)和江苏(92.98%)较高,甘肃(74.42%)和湖北(78.13%)较低;入伍前工作与否者的抗体阳性检出率差异无统计学意义。结论入伍新兵人群中HSV-Ⅰ感染水平较高,呈逐年降低趋势并有非常显著性地区差异;新兵入伍期间,应采取健康教育等有效预防措施,降低人群HSV-Ⅰ感染水平。

鸭Ⅰ型肝炎病毒荧光定量RT-PCR方法建立及初步应用

根据GenBank中鸭Ⅰ型肝炎病毒的基因序列,设计合成一对引物和一条Taq-Man探针。进行优化后,建立了能够检测鸭Ⅰ型肝炎病毒的荧光定量RT-PCR方法。该方法敏感性好,检测敏感性达到20个模板拷贝数,比常规PCR灵敏度高100倍;该方法特异性强,对番鸭细小病毒、鸭圆环病毒和鹅细小病毒等6种病原体的检测全为阴性。对广西地区鸭群收集的118份病料进行检测,结果阳性率为1.69%。结果提示:在广西地区的鸭群中,存在鸭Ⅰ型肝炎病毒的感染,建立的荧光定量RT-PCR方法可用于鸭Ⅰ型肝炎病毒的临床快速检测。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

参考GenBank中Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒(DHV-Ⅰ)的基因序列,应用Primer Premier5.0软件设计了一对引物,建立了适合DHV-Ⅰ快速检测的RT-PCR检测方法。以该方法对实验室分离并保存的DHV强毒株Z10株的RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到了预期大小为699 bp的目的片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果与GenBank中的DHV-Ⅰ的相应基因序列比对分析,同源性均达90%以上,表明为DHV-Ⅰ的基因序列,对NDV,IBDV,DPV和GPV等常见病毒扩增结果为阴性。该方法敏感性检测结果表明,最低RNA模板检出量为24 pg。表明所建立的RT-PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于I型鸭病毒性肝炎病毒的快速诊断。

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据Genebank中I型鸭病毒性肝炎病毒的基因序列,设计合成了2对引物,以山东、江苏、广东、河南等地分离株的RNA为模板进行RT-PCR扩增,均得到预期大小的目的片段,两对引物的检测结果一致。并对其中一种方法的敏感性、特异性进行了检测,结果表明本试验建立的用于I型鸭病毒性肝炎病毒诊断的RT-PCR方法具有较高的敏感性和特异性,最低RNA模板检出量为100pg,只能特异的检测出I型DHV,不能检出NDV、IBDV、DPV和GPV。因此,所建立的RT-PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于鸭病毒性肝炎病毒的快速鉴别诊断。

银黄注射液体内外抗Ⅰ型疱疹病毒的实验研究

目的观察银黄注射液的体内外抗疱疹病毒I型(HSV-I)作用。方法用HSV-I Sm44株颅内感染BALB/C小鼠复制动物模型,记录小鼠存活时间;用HSV-I Sm44株感染的Vero细胞为实验系统,观察细胞病变程度,从而了解银黄注射液抗HSV-I的药效。结果体外实验表明,先用药后感染病毒,银黄注射液0.22 mg.m-l1以上可抑制HSV-ⅠSm44株对Vero细胞的病理损伤,病毒唑0.25 mg.m-l1以上可抑制HSV-ⅠSm44株对Vero细胞的病理损伤,先感染HSV-Ⅰ后用药,银黄注射液0.22 mg.m l-1不能抑制Vero细胞的病理损伤;动物实验表明,静注66 mg.kg-1.d-1银黄注射液可显著延长感染HSV-ⅠSm44株的小鼠存活天数(P<0.01),作用优于病毒唑,肌注作用差。结论体外实验,银黄注射液阻断Ve-ro细胞感染HSV-ⅠSm44株作用强于对已感染该病毒的Vero细胞的保护作用;对HSV-ⅠSm44株感染小鼠有保护作用,静注比肌注效果好,静注大剂量保护作用优于病毒唑。

猪伪狂犬病病毒野毒SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

根据猪伪狂犬病病毒(PRV)g I/g E基因序列,设计一对特异性引物,建立了鉴别PRV野毒感染的荧光定量PCR方法。该方法灵敏度达到102拷贝/μL,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、乙脑病毒(JEV)不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;用PRV强毒攻毒仔猪,荧光定量PCR比普通PCR能更灵敏检出组织带毒量。该方法可以用于猪的组织样品,如脑、肺、扁桃体、淋巴结等样品中伪狂犬野毒的定量,可用于临床伪狂犬野毒感染的早期检测和定量分析猪伪狂犬病毒感染程度。

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP1基因在昆虫细胞中的表达及鉴定

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-Ⅰ)的主要结构蛋白VP1,根据GenBank已发表的DHAV-ⅠSH株VP1基因序列,设计1对特异性引物,通过RT-PCR扩增VP1基因,将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac1,获得重组杆状病毒转移载体p FB-VP1,将其转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经抗性、蓝白斑筛选及PCR鉴定后,构建重组穿梭质粒rBacmid-VP1。在脂质体介导下将重组质粒rBacmid-VP1转染昆虫细胞Sf 9,制备含有DHAV-ⅠVP1基因的重组杆状病毒rBac-VP1。Western blot结果显示,表达的重组蛋白VP1大小约27 ku,能与DHAV-ⅠVP1多克隆抗体发生特异性反应;间接免疫荧光检测结果显示,重组蛋白VP1能与DHAV-Ⅰ全病毒阳性血清发生特异性反应,细胞内出现较强的荧光。以上结果表明,在昆虫细胞中成功表达了具有免疫原性的DHAV-Ⅰ主要结构蛋白VP1。

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因在杆状病毒表达系统中的表达

为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株的结构蛋白VP0,首先根据DHAV-Ⅰ SH株VP0基因序列设计一对引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,亚克隆至杆状病毒转移载体pFast Bac1,获得重组质粒p FB-VP0,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-VP0,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-VP0。Western-blot结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为29 k D,间接免疫荧光结果显示重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。研究结果表明,DHAV-Ⅰ SH株的结构蛋白VP0在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP0结构蛋白的功能研究和基因工程疫苗的研制奠定了基础。

福建省两株HTLV-Ⅰ前病毒外膜区部分env核苷酸序列测定及分析

目的 :了解我国福建省HTLV Ⅰ感染的来源和亚型。方法 :对福建省发现的两株HTLV Ⅰ ,用PCR扩增HTLV Ⅰ部分env 5 2 2bp的片段 (gp46 5’末端和 gp2 1的大部分 ) ,全自动测序仪测序 ,并分析此两株HTLV Ⅰ与HTLV Ⅰ各亚型代表株的核苷酸、氨基酸的同源性。结果 :获得福建省两株HTLV Ⅰ的部分env核苷酸序列 (6 0 6 5～ 6 5 44 )和编码氨基酸序列 (2 96～ 45 5 )。结论 :福建省的这两株HTLV Ⅰ与日本的HTLV Ⅰ (MT2和H5 )核苷酸、氨基酸序列接近 ,属A亚型。

鸭甲型肝炎病毒-Ⅰ型3D基因在昆虫细胞中的表达及抗原检测

通过高保真PCR方法扩增出鸭甲型肝炎病毒-Ⅰ型(DHAV-Ⅰ)RNA依赖的RNA聚合酶3 D基因,克隆至杆状病毒表达载体pFastBac1中,构建重组杆状病毒转移载体pFB-3D,将其转化感受态细胞DH10Bac,获得重组杆粒rBacmid-3D,转染昆虫细胞Sf9,收获重组杆状病毒rBac-3D,通过间接免疫荧光、Western blot对重组蛋白的表达水平进行检测。结果表明:间接免疫荧光数据显示表达的重组蛋白能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性结合,Western blot表达的重组蛋白分子量约为51ku,与理论值相符。这一研究说明3D蛋白在昆虫细胞中获得成功表达,为DHAV-Ⅰ型ELISA检测试剂盒的研制提供了技术基础。

Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒VP0基因的原核表达与多抗的制备

根据Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis A Virus type-Ⅰ,DHAV-Ⅰ)SH株VP0基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR方法扩增出VP0基因,克隆入原核表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下重组蛋白获得了成功表达。SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白相对分子量约为48 k D,Western-blotting分析表明该蛋白能与His组氨酸单抗发生特异性反应。将目的蛋白切胶纯化后免疫ICR小鼠,制备了针对重组蛋白的多抗血清,Western-blotting分析证明制备的抗血清能够与DHAV-Ⅰ感染的SPF鸡胚尿囊液总蛋白发生特异反应。以上结果表明,VP0基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于VP0蛋白的检测。

羊O／P液中AsiaⅠ型口蹄疫病毒VP1基因3′端序列的分析

从宁夏中卫AsiaⅠ型口蹄疫疫区的无临床症状羊采集的食道咽部分泌液（OPF）中扩增得到了4个口蹄疫病毒（FMDV）VP1基因3′-端483bp（VP483）片段。核苷酸和氨基酸序列比较结果表明，从4份OPF中扩增出的VP1片段，在细胞受体结合位点处的关键氨基酸与目前公布的FMDVAsiaⅠ型流行毒相比均发生了改变，由RGD变成RDD。4个扩增片段的核苷酸序列与AsiaⅠ／js／WX／05株相比，同源性为96．2％～98、3％，表明与AsiaI／JS／WX／05株高度同源。蛋白结构模拟结果显示，这种改变会导致G—H环柔性减弱，这可能是AsiaⅠ／JS／WX／05FMDV适应羊体，造成持续感染后发生的一种变异。