土壤原核微生物RNA加Poly(A)尾的方法研究

采取共提取法提取土壤微生物总RNA后,经过去DNA、过柱纯化等手段,利用Poly(A)聚合酶在纯化RNA末端添加Poly(A)尾,将产物逆转录成c DNA第一链,用细菌16S r DNA引物和nos Z(氧化亚氮还原酶基因)引物扩增目的片段。结果表明:利用此方法能够获得带有Poly(A)尾的土壤原核微生物核糖体RNA和m RNA,产物经过一次转录后,可用于扩增土壤微生物目的基因。此方法相对于利用目的基因特异下游引物来作为逆转录引物获得c DNA更加方便,用于研究土壤原核微生物多个基因的表达特征时,此方法十分实用。

poly(A)尾对猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组感染性的影响

大部分单股正链RNA病毒的基因组末端含有poly(A)尾,这对病毒基因组RNA的感染性起着非常重要的作用。本研究以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆pCBC2为平台进行反向遗传操作,通过突变PCR获得poly(A)尾长度分别为0、5、8、9、10、22、35的全长突变体克隆,经体外转录转染MARC-145细胞,观察细胞病变(CPE),对于能产生CPE的突变克隆,抽提细胞上清中的病毒RNA,通过G-Tailing法鉴定子代病毒基因组的poly(A)尾长度。结果表明:1、poly(A)尾影响PRRSV基因组的感染性,且最小长度为10;2、PRRSV基因组poly(A)尾在感染细胞过程中能被修复。

Poly(A)尾长度和异质性在转录后调控中的研究进展

Poly(A)尾在真核生物mRNA转录后调控中具有关键的功能,是mRNA稳定性和翻译的重要决定元件.但早些年poly(A)尾序列很难被精确解读,导致了对其转录后调控的相关研究相对滞后.近年来,随着针对poly(A)尾精确读取的高通量测序技术的建立及快速发展,使poly(A)尾在转录后调控中的作用及其机制已逐渐成为前沿研究热点.文章综述了poly(A)尾长度和异质性对mRNAs稳定性和翻译效率的影响及其在一些生物学过程中的调控作用;同时介绍了胞质poly(A)结合蛋白PABPC在poly(A)尾转录后调控中的双重作用.本文对了解poly(A)尾长度和异质性变化在转录后调控及一些生物学过程中的作用具有一定的参考价值。

哺乳动物卵子与早期胚胎中全转录组poly(A)尾研究进展

在哺乳动物卵子向胚胎转变过程中,卵子和胚胎中的转录在合子基因组激活之前都是沉默的,因此mRNA转录后修饰在此过程发挥着重要的作用。poly(A)尾巴是影响mRNA命运和翻译效率的一种重要的转录后修饰。随着测序技术和分析工具的进步,尤其是三代测序技术的发展,poly(A)尾的长度和组成能够被精确测量,极大地拓展了人们对于poly(A)尾在哺乳动物早期胚胎发育过程中的认识。本文对poly(A)尾研究方法的发展及其在卵子向胚胎转变中的研究进展进行评述,以期为哺乳动物早期胚胎发育和不孕不育相关疾病的研究带来新的思路。

利用eIF4E分离纯化非编码RNA的新方法

人翻译起始因子eIF4E是特异性识别并结合mRNA帽结构的蛋白质.该文通过克隆人源基因eIF4E,并利用原核细胞大肠杆菌BL21成功表达了具有帽结合功能的eIF4E蛋白,利用该蛋白亲和纯化分离得到了具有帽子结构的RNA.通过对比用oligo(dT)分离得到的非编码RNA,eIF4E法得到了更多种类的非编码RNA.本研究为非编码RNA的分离与发现提供了一个重要的工具.

不同长度poly(A)尾对mRNA体外表达的影响及转录模板在大肠埃希菌中的传代稳定性

目的探索不同长度poly(A)尾对mRNA体外表达的影响以及含poly(A)尾转录模板在大肠埃希菌中的传代稳定性。方法设计并构建含38、60、103、125 nt和60 nt+6 nt间隔序列+60 nt(简称126 nt)poly(A)尾的模板质粒,利用单酶切将其线性化并以此作为转录模板进行体外转录反应制备增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)-mRNA。将含有不同长度poly(A)尾的EGFP-mRNA转染293T细胞,流式细胞术检测EGFP表达情况。将poly(A)尾长度为125 nt和126 nt的模板质粒分别转化至大肠埃希菌TransStbl3感受态细胞以及Top10感受态细胞中,各挑取7个单克隆进行培养并提取质粒,质粒经双酶切后进行毛细管电泳检测。分别从中选取3个测序正确的单克隆于37℃条件下进行连续传代,每两代提取一次质粒,双酶切后进行毛细管电泳检测。同时将poly(A)尾长度为125 nt的两组单克隆再分别于30℃条件下进行连续传代,每两代提取一次质粒并进行双酶切鉴定和毛细管电泳检测。结果成功构建了含不同长度poly(A)尾的转录模板。流式细胞术结果显示,poly(A)尾长度为103 nt和125 nt的模板质粒荧光表达明显高于poly(A)尾长度为38 nt与60 nt的模板质粒。poly(A)尾长度为126 nt的模板质粒荧光表达显著高于其他组。poly(A)尾长度为125 nt的模板质粒转化TransStbl3感受态细胞和Top10感受态细胞后稳定序列的百分比分别为76%和91%,37℃条件下连续传代均可稳定传代至第4代,30℃条件下连续传代可分别稳定传代至第16代和第10代。poly(A)尾长度为126 nt的模板质粒转化TransStbl3感受态细胞和Top10感受态细胞后稳定序列的百分比分别为95%和48%,37℃条件下连续传代均可稳定传代至第12代。结论mRNA中poly(A)尾的长度和组成对目的蛋白的表达均有影响,在poly(A)尾中添加长度为6 nt的间隔序列以及30℃低温培养均有助于增加模板质粒的传代稳定性,为mRNA疫苗体外转录模板的设计和生产制备提供参考。