Poly(I:C)模拟RNA病毒在气道炎症研究中的应用

目的使用poly(I:C)模拟RNA病毒感染,建立一个安全有效的病毒感染模型,探讨病毒诱发气道的炎症。方法BALB/c小鼠随机分为对照组和poly(I:C)组,poly(I:C)组连续3d应用poly(I:C)滴鼻后,连续5d观测小鼠肺泡灌洗液(BALF)细胞学改变,ELISA测定IFN-γ浓度,同时观察小鼠肺病理改变。结果对照组小鼠BALF中中性粒细胞数和IFN-γ浓度分别为(1.53±0.06)×106/L和(7.11±1.11)ng/L。自Poly(I:C)滴鼻后第1天起,小鼠BALF中性粒细胞数和IFN-γ浓度开始升高,分别为(2.00±0.12)×106/L和(8.01±1.79)ng/L,肺间质内出现炎症细胞。这些变化在滴鼻后的第3天达到高峰,BALF中性粒细胞数和IFN-γ浓度分别为(4.30±0.32)×106/L和(13.51±1.40)ng/L,大量炎症细胞聚集在肺间质,随后炎症变化开始下降。对照组和poly(I:C)刺激组的BALF中淋巴细胞数均为(2.10±0.11)×106/L。结论Poly(I:C)可以模拟RNA病毒感染,诱发病毒感染相似的气道炎症,促使中性粒细胞聚集,破坏正常气道,刺激IFN-γ分泌。但是poly(I:C)诱发的气道炎症是有时间限制的。

尼罗罗非鱼钙结合蛋白S100P基因的克隆及功能分析

为探究尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)钙结合蛋白S100P基因(On S100P)的功能,根据从罗非鱼头肾转录组获得的On S100P序列设计特异性引物,克隆得到On S100P,并对其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析,利用荧光定量PCR技术,研究其在不同组织中的定位和表达水平及Poly(I∶C)刺激后该基因在各个组织中的表达模式,并表达与制备了重组蛋白,用于孵育尼罗罗非鱼头、肾、淋巴细胞后研究其对炎症因子转录的调控作用。结果表明:On S100P基因CDS长度为288 bp,可编码96个氨基酸,含有S100蛋白家族的保守结构域;系统进化树结果分析表明,尼罗罗非鱼同斑马丽鱼(Maylandia zebra)的S100P具有较高的同源性;组织分布分析显示,On S100P在尼罗罗非鱼的不同组织中均有表达,其中以肌肉和鳃的表达量最高;经Poly(I∶C)刺激后,罗非鱼肠道、头肾和脑组织中On S100P表达水平显著升高且刺激24 h后达到高峰;制备的On S100P重组蛋白(rOn S100P)可诱导肾淋巴细胞MIF、IL8、TNF-β及IL1-β的表达。研究表明,On S100P氨基酸序列具有S100保守结构域,与其他S100蛋白家族成员类似,可通过调节淋巴细胞炎症因子的表达影响鱼类的免疫应答。

鲤环指蛋白145基因克隆、生物信息学及功能分析

【目的】试验旨在克隆鲤(Cyprinus carpio)环指蛋白145(ring finger protein145,RNF145)基因CDS区,并对其进行生物信息学分析及功能初探。【方法】对鲤RNF 145基因进行了克隆并测序,通过在线软件对鲤RNF145蛋白进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR分析鲤RNF 145基因在不同发育阶段、不同组织中及在鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp virus,SVCV)和Poly(I∶C)刺激下的mRNA表达变化。【结果】鲤RNF 145基因CDS序列全长2049 bp,编码682个氨基酸,其氨基酸序列与鲫相似性最高;鲤RNF145蛋白分子质量为76.56 ku,理论等电点为6.16,脂肪系数为115.32%,不稳定指数为41.87,无信号肽,含有11个跨膜螺旋,属跨膜蛋白;亚细胞定位预测结果显示,其定位于细胞质膜(87%)和内质网(13%);该蛋白含有TRC8-N、RING_H2_RNF145和RAD18结构域,具有α-螺旋(56.45%)、延伸链(9.68%)、β-转角(2.35%)及无规则卷曲(31.52%),与MFN2、NUGGC.1、ASZ1和TRIM36相互作用的置信度较高。早期发育阶段鲤RNF 145基因mRNA表达呈先显著下降后上升,再显著下降趋势(P<0.05);组织表达谱分析表明,其在脾脏中表达量最高,在肝脏中表达量最低;SVCV1(5.6×107 TCID 50/mL)在体感染24 h后,RNF 145基因在肌肉、脾脏、头肾、心脏中表达量均显著升高,在肝脏中则显著下降(P<0.05);该剂量感染鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum crprini,EPC)时,RNF 145基因表达量在12 h时开始显著升高,于48 h时仍显著高于对照组(P<0.05);SVCV2(5.6×104 TCID 50/mL)感染EPC时,鲤RNF 145基因mRNA表达量在感染后24 h时显著高于对照组,48 h后显著低于对照组(P<0.05)。与SVCV1刺激结果不同,在体注射Poly(I∶C)(1000μg/mL)24 h后,该基因在脾脏和头肾中表达量均显著低于对照组(P<0.05);Poly(I∶C)(10μg/mL)感染EPC时,鲤RNF 145基因mRNA表达量在感染后24 h时显著高于对照组,48 h后显著低于对照组(P<0.05)。【结论】本试验成功克隆了鲤RNF 145基因的CDS全长序列,揭示了其在不同组织、早期不同发育阶段及SVCV和Poly(I∶C)刺激下的表达变化,为进一步研究该基因功能提供了前期基础。

Toll样受体3对胰岛β细胞增殖及胰岛素分泌的影响

目的通过Toll样受体3(TLR3)激动剂Poly(I∶C)(PIC)刺激小鼠胰岛β细胞,观察TLR3对细胞增殖,炎性因子表达及胰岛素分泌的影响。方法用小鼠胰岛β细胞株NIT-1为研究对象,首先测定胰岛素释放以鉴定胰岛β细胞生物活性,再分别用不同浓度PIC(0.1、1、10μg/mL)刺激NIT-1细胞,CCK-8法检测细胞增殖;酶联免疫法(ELISA)检测炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β),IL-6及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达;葡萄糖刺激下的胰岛素释放试验(GSIS)测定NIT-1细胞分泌胰岛素功能。结果 NIT-1细胞株呈贴壁、成簇及多边形生长;胰岛β细胞生物活性较好。与对照组相比,用不同浓度PIC(0.1、1、10μg/mL)刺激时,NIT-1细胞增殖明显受到抑制,且呈剂量依耐性(P<0.05)。PIC刺激组炎性因子(IL-1β,IL-6及TNF-α)表达明显高于对照组(P<0.05)。PIC刺激可明显抑制高糖介导下的NIT-1细胞分泌胰岛素(P<0.05)。结论 PIC激活胰岛β细胞TLR3,通过释放IL-1β、IL-6及TNF-α,抑制胰岛β细胞生长及胰岛素分泌。

鸭IFN-β启动子及其NF-κB结合位点荧光素酶报告质粒的构建与活性检测

通过PCR方法,扩增得到鸭I型干扰素β(IFN-β)基因启动子功能区域的DNA片段和其4个重复NF-κB结合位点的DNA片段,亚克隆到含萤火虫荧光素酶报告基因pGL4.2-basic载体上,构建了包含鸭IFN-β启动子及其NF-κB结合位点的荧光素酶报告质粒pduIFN-β-luc和4×NF-κB-luc;分别将构建的两个报告质粒与海肾荧光素酶内参质粒pRL-TK用JetPEITM转染试剂共转染至鸭胚成纤维细胞系DEF,在转染24 h后,用poly(I∶C)刺激转染细胞,结果表明,与未刺激组相比,刺激组的荧光素酶活性均显著增加。为进一步研究鸭天然免疫信号通路提供了重要的研究工具。

Poly(I∶C)增强口蹄疫病毒样颗粒疫苗免疫效果的研究

口蹄疫是一种高度接触性传染病,严重影响着畜牧业的健康发展。目前主要通过接种疫苗对其进行预防。近年来,病毒样颗粒(virus-like partic,lVeLsPs)疫苗由于具有天然病毒相似的结构、不含有病毒的遗传物质、易被免疫细胞识别等优点,逐渐成为研究的热点。为了进一步提高口蹄疫VLPs疫苗的免疫效果,本研究选取poly(I∶C)联合ISA 201共同使用,以探究poly(I∶C)对口蹄疫VLPs疫苗免疫效果的影响。结果,poly(I∶C)可以刺激机体产生更高水平的特异性抗体和中和抗体以及IF N-γ、T NF-α和IL-4等细胞因子的分泌,从而引起机体产生更强的体液免疫应答和细胞免疫应答,进而保护动物机体免受口蹄疫病毒的攻击。

尼罗罗非鱼干扰素诱导蛋白44基因克隆及表达分析

【目的】探索干扰素诱导蛋白44基因(ifi44)在尼罗罗非鱼各组织的分布特征及其响应无乳链球菌感染和聚肌胞苷酸[Poly(I∶C)]刺激过程中的表达模式,为进一步揭示ifi44基因在鱼类免疫应答中的作用机制打下基础。【方法】克隆On-ifi44基因开放阅读框(ORF),通过ExPASy、TMHMM-2.0、Euk-mPLoc 2.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,根据单细胞转录组测序结果分析On-ifi44基因在细胞层面的分布情况,并采用实时荧光定量PCR检测On-ifi44基因在尼罗罗非鱼各组织中的表达分布特征及在无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后的时序表达情况。【结果】On-ifi44基因ORF序列全长1437 bp,编码478个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为52.7 kD,理论等电点(pI)为4.97。On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域(1~157 aa)和1个GTP-bd结构域(197~322 aa),不含跨膜结构域。On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗非鱼ifi44氨基酸序列的相似性为97.94%;基于ifi44氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗罗非鱼ifi44氨基酸序列聚为一支,二者具有较近的亲缘关系。On-ifi44基因在尼罗罗非鱼的肠道、肝脏、鳃、皮肤、脾脏、体肾、胸腺、脑、头肾、肌肉、心脏等11个组织中均有表达,且主要在T细胞亚群表达;经无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后,On-ifi44基因在尼罗罗非鱼脾脏、肾脏、头肾和肠道组织中的相对表达量均发生变化,且存在明显的时间依赖性。【结论】On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域和1个GTP-bd结构域,进化保守且在不同物种间具有相似的生物学功能;On-ifi44基因在无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后呈时间依赖性上调表达,表明ifi44基因作为重要的调节因子,参与了尼罗罗非鱼抗细菌感染、抗病毒增殖的免疫应答过程。

鸭IFN-β启动子区域IRF1结合位点荧光素酶报告质粒的构建与活性检测

构建并鉴定鸭Ⅰ型干扰素β(IFN-β)基因启动区域的IRF1结合位点荧光素酶报告基因载体,并进行转录活性分析。通过PCR方法从鸭脾脏cDNA中克隆得到鸭干扰素启动子区域IRF1结合位点,通过连接转化亚克隆至含萤火虫荧光素酶报告基因pGL4.2-basic载体上,构建得到4个重复鸭源IRF1结合位点的荧光素酶报告基因载体4×IRF1-luc;用JetPEITM转染试剂将构建的报告基因转染至鸭胚成纤维细胞系DEF,在poly(I∶C)的刺激下,荧光素酶活性显著增加。