PolyI∶C不同途径诱导大菱鲆Mx蛋白基因的转录

以PolyI∶C(又称聚肌胞)为诱导剂,分别通过腹腔注射、浸泡和投喂3种途径诱导大菱鲆Scophthalmus maximus体内抗病毒蛋白Mx基因的转录,利用半定量RT-PCR方法检测干扰素下游基因-Mx基因的转录水平来确定该诱导剂的诱导效果。结果显示,以上3种途径都能高效诱导Mx蛋白mRNA的转录,均在48h之后达到高峰,其中以浸泡的方式更容易诱导Mx基因转录,且在120h时仍保持较高水平。Mx基因转录的时相变化证明了国产PolyI∶C可以通过多种途径诱导抗病毒蛋白Mx的表达,为实际应用中确定用药途径提供了理论依据。另外,实验初步建立了半定量RT-PCR方法,为检测鱼体内干扰素的表达提供了技术方法。

PolyI:C体外诱导草鱼PKR基因的克隆与表达

[目的]克隆草鱼的PKR基因,为草鱼抗病毒基因研究奠定基础。[方法]依据GenBank上斑马鱼(AJ852023.1)和鲫鱼(AY293929.1)的PKR基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计了3对简并引物;采用100μg/ml PolyI:C体外分别处理草鱼肾细胞(Ctenopharyngodon indellus kidney cells,CIK)12、36、48 h,并提取处理后细胞的总RNA,逆转录后用降落PCR方法扩增这3个处理时间细胞中PKR基因。[结果]处理12 h时未扩增出PKR基因,处理36和48 h时都扩增到了PKR基因,并且表达量随处理时间的增加有所升高,扩增到的部分序列与鲫鱼和斑马鱼的该段序列同源性分别为100.00%和81.48%。[结论]试验成功获得了草鱼PKR基因的部分序列,PolyI:C高效诱导草鱼PKR蛋白表达将有助于开创治疗草鱼类病毒病的一种新思路。

TLR4通路对polyI:C诱导肝癌细胞凋亡的影响

目的:研究TLR4信号通路活化对polyI:C诱导人肝癌细胞系H7402凋亡的影响,并分析其可能的作用机制。方法:用TLR4激动剂LPS处理H7402细胞24 h后,转染polyI:C刺激24 h,然后利用流式细胞术检测细胞凋亡,荧光定量PCR检测凋亡基因及胞内RNA模式识别受体TLR3、MDA5、RIG-I和LGP2的表达,Western blot检测识别受体的蛋白表达水平。结果:LPS预处理,减弱了polyI:C诱导H7402细胞凋亡的作用。同时,促凋亡基因Noxa的表达水平降低。在此过程中polyI:C的胞内识别受体RIG-I、MDA5的基因和蛋白水平表达下调。结论:LPS可能通过降低H7402细胞内dsRNA识别受体的表达,抑制了polyI:C诱导H7402细胞凋亡的作用。

PolyI∶C复合物对小鼠体内非小细胞肺癌移植瘤的作用

目的:探讨PolyI∶C复合物对小鼠体内非小细胞肺癌(NSCLC)移植瘤的作用。方法:将C57BL/6小鼠随机分为4组,每组6只,均皮下注射LL/2细胞建立NSCLC移植瘤模型。当肿瘤体积达到100 mm3时,滴鼻组每隔1天PolyI∶C滴鼻1次(0.3 mg/次),肌注组每隔1天肌内注射PolyI∶C 1次(0.3 mg/次),PBS组每隔1天PBS滴鼻1次(100μL/次),PD1组腹腔注射PD1(100μg/次,1周1次)。用药2周后处死小鼠,剥离移植瘤及脏器组织,TUNEL法检测移植瘤组织内细胞凋亡,HE染色观察各脏器肿瘤转移情况。结果:给药后4组小鼠体重均逐渐增加,但肌注组小鼠体重增加幅度小于其他3组(P<0.05)。滴鼻组和肌注组移植瘤体积较PBS组减小(P<0.05),而肌注组减小更为显著(P<0.05)。滴鼻组、肌注组和PD1组抑瘤率分别为(38.33±0.05)%、(50.39±0.03)%、(15.17±0.05)%,肌注组抑瘤率最高(P<0.05)。滴鼻组、肌注组及PD1组肿瘤细胞凋亡均较PBS组增强,且肌注组变化最为显著(P<0.05)。肌注组小鼠各脏器均未发生转移。结论:PolyI∶C复合物对小鼠体内NSCLC移植瘤具有明显的抗肿瘤、抗转移作用。

Poly I∶C对人前列腺癌细胞PC-3M的生长抑制作用

目的:观察聚肌胞(PolyI∶C)对体外培养的人前列腺癌细胞PC-3M生长的抑制作用。方法:前列腺癌PC-3M细胞经不同剂量PolyI∶C(100、200和400μg.L-1)作用后,相差显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞生长抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期变化。结果:对照组细胞呈梭形贴壁生长,细胞数目多,PolyI∶C组细胞变圆贴壁不佳,细胞数目变少。PolyI∶C 400μg.L-1组的生长抑制率最高,200μg.L-1组次之,100μg.L-1组最低,三组间比较差异有显著性(P<0.05);Poly I∶C同一剂量组生长抑制率72 h最高,48 h次之,24 h时最低,三组间比较差异有显著性(P<0.05)。流式细胞检测结果显示:PolyI∶C可诱导PC-3M凋亡,凋亡率呈剂量依赖性,分别为3.9%、27.1%和42.9%,三组间比较差异有显著性(P<0.05)。PolyI∶C组细胞处于G1期的百分率(61.4%)明显高于对照组(33.9%)(P<0.05)。结论:PolyI∶C能抑制体外培养的PC-3M细胞生长,对PC-3细胞有显著的增殖抑制作用,呈剂量依赖性和时间依赖性,其机制可能与细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡有关。

聚肌胞对小鼠前列腺癌的抑制作用

目的:观察聚肌胞对小鼠前列腺癌的抑制作用。方法:将16只C57BL6/J纯系荷瘤小鼠按瘤重采用区组随机分组方法分为对照组和聚肌胞组,每组8只,每隔2日分别瘤内注射生理盐水和聚肌胞,第7次后切除瘤灶,称瘤重,计算瘤重抑制率,绘制前列腺癌生长曲线及荷瘤鼠生存曲线。前列腺癌组织HE染色观察形态学变化。结果:对照组和聚肌胞组瘤重分别为(4·14±1·56)和(1·58±0·67)g,两组瘤重比较差异具有显著性(P<0·05);聚肌胞组瘤重抑制率为67·85%;前列腺癌生长曲线显示,聚肌胞组小鼠前列腺癌生长较慢;聚肌胞组荷瘤小鼠的生存时间较对照组长(P<0·05);病理显示对照组较聚肌胞组前列腺癌细胞增殖活跃。结论:聚肌胞可以减慢小鼠前列腺癌的生长,延长荷瘤小鼠生存时间。

裸鼹鼠抵抗病毒感染相关机制的初步研究

目的 探讨多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐（PolyI∶C）诱导下裸鼹鼠肺脏、肠组织的病理变化以及低氧诱导因子（HIF-1 α）和坏死因子（NF-κB）信号通路关键基因的表达水平,分析裸鼹鼠抵抗病毒可能的分子机制.方法 裸鼹鼠分为PolyI∶C处理组、生理盐水对照组.注射12h后处死动物,肺脏和肠组织切片经HE染色后观察病理变化;提取裸鼹鼠肺脏、肠组织中mRNA,采用半定量RT-PCR方法检测基因HIF-1 α、VEGFb（血管内皮生长因子b）、VEGF c（血管内皮生长因子c）、FLT-1（血管内皮生长因子受体1）、Fiz1（血管内皮生长因子受体3结合锌指蛋白1）、NKRF（转录因子NRF蛋白）的表达水平.结果 与对照组相比,PolyI∶C处理组的肺脏和肠组织病理变化不明显,而所检测基因的表达水平几乎都显著下降,仅肠组织中的FIZ1的表达水平有所上升（P＞0.05）.结论 PolyI∶C对裸鼹鼠没有产生明显的致病作用,它不能诱导裸鼹鼠体内HIF-1α和NF-κB信号通路活化,提示裸鼹鼠可能通过抑制相关信号通路的活性促使体内受感染的靶细胞迅速凋亡,从而清除入侵的病原体.

基于表达谱芯片挖掘抗猪瘟病毒相关基因及其在不同猪瘟抗体水平下的表达差异

本研究旨在筛选抗猪瘟病毒相关基因,并分析不同猪瘟抗体水平下这些相关基因在大白和长白猪中的表达差异。首先,基于表达谱芯片技术,采用Agilent猪4×44K全基因组表达谱芯片,分析4组试验材料(病毒模拟物PolyI:C转染的猪PK15细胞、甲基化酶抑制剂Aza-CdR转染的PK15细胞、PolyI:C及Aza-CdR共同转染的PK15细胞、无处理的mock细胞),获得试验组间显著性差异表达基因。进而对差异表达基因进行聚类分析和Gene Ontology(GO)分析。结果表明,存在显著差异表达的抗粘液病基因(MX1)和双链RNA依赖的蛋白激酶R基因(PKR)主要参与抗病毒相关的生物学过程。分析2个基因在不同猪瘟抗体水平下大白猪与长白猪外周血中的表达情况发现,2个基因在猪瘟高抗组中的表达量均显著高于未免疫组(P<0.05)。此外,MX1在猪瘟高抗组中的表达存在品种间差异,大白猪中的表达量极显著高于长白猪(P<0.01)。鉴于MX1和PKR基因都是干扰素通路中的重要基因,本研究结果提示,MX1和PKR基因可作为针对抗猪瘟病毒感染的重要候选基因。

聚肌胞对人脐血内皮祖细胞增殖和凋亡的影响及其机制

目的观察Toll样受体3(TLR3)的配体聚肌胞(Poly I∶C)对人脐血内皮祖细胞(EPC)增殖、凋亡的影响并阐明其具体机制。方法采用不同浓度的聚肌胞持续干预EPC,通过流式细胞术检测聚肌胞对EPC细胞周期时相分布及细胞凋亡的影响。利用CCK-8细胞增殖试验分别检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)对细胞凋亡的影响,以及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶Caspase 8、Caspase 9的抑制剂、IL-1β受体的中和抗体对聚肌胞诱导EPC凋亡的作用。结果与对照组相比,较高浓度的聚肌胞(1、10 g/L)显著减少S期和G2/M期细胞比例,并通过下调细胞周期蛋白A、B1、D1、E的表达阻滞细胞周期于G0/G1期;同时聚肌胞还呈剂量依赖性诱导EPC凋亡。Caspase 8和Caspase 9的抑制剂并不能抑制聚肌胞诱导的细胞凋亡;TNF-α对EPC的凋亡率无影响;IL-1β呈剂量依赖性诱导EPC凋亡;而使用IL-1β受体的中和抗体anti-IL-1R1预先封闭IL-1β的结合位点后,再加入聚肌胞干预,结果发现高浓度的anti-IL-1R1可以部分抑制聚肌胞诱导的细胞凋亡。结论高浓度的聚肌胞通过将细胞周期阻滞于G0/G1期并诱导细胞凋亡从而抑制EPC增殖。聚肌胞活化TLR3后通过上调IL-1β的表达诱导EPC凋亡,而内、外源性细胞凋亡途径及TNF-α均不参与聚肌胞诱导的细胞凋亡。

聚肌胞诱导新城疫病毒感染肉鸡α-干扰素及免疫活性研究

对人工感染新城疫病毒的肉鸡注射聚肌胞,测定其诱导肉鸡α-干扰素、特异性和非特异性免疫功能,以研究聚肌胞对感染病毒畜禽诱导IFN-α的确实效果以及免疫活性状态。结果显示,注射0.02 mg/kg(bw),0.01 mg/kg(bw)和0.005 mg/kg(bw)的聚肌胞后,肉鸡死亡率分别为40%、20%和26.7%,均极显著低于攻毒对照组的63.3%(P<0.01);聚肌胞剂量增加,诱导IFN-α的能力升高,但超过一定范围后反而出现抑制;3个剂量的聚肌胞对肉鸡外周血CD3+细胞均显示出较明显的提升效果,而各用药组肉鸡体内的新城疫抗体水平与攻毒对照组相比差异并不显著。说明聚肌胞的抗病毒作用可能一方面通过诱导IFN-α以降低NDV对淋巴细胞的损害;另一方面参与提高机体的细胞免疫发挥作用,在体液免疫方面并没有显示明显增强作用。

孕期感染聚肌胞苷酸大鼠子代海马及额叶星形胶质细胞活化研究

目的研究聚肌胞苷酸(PolyI:C)孕期感染所致子代精神分裂症大鼠海马及额叶星形胶质细胞活化特点,探讨星形胶质细胞参与神经炎症反应在精神分裂症病理机制中的作用。方法将18只孕鼠随机分为模型组、双倍剂量组和对照组,每组6只。于孕9 d给予尾静脉注射药物,模型组和双倍剂量组分别注射5、10 mg·kg-1PolyI:C,对照组注射等体积(按5 mg·kg-1PolyI:C)生理盐水。待仔鼠8周龄时进行行为学评估,采用免疫组织化学技术检测脑内胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果模型组和双倍剂量组仔鼠移动总路程与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);共济失调和刻板行为评分大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);模型组与双倍剂量组仔鼠移动总路程、共济失调和刻板行为评分比较差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组和双倍剂量组仔鼠T1高于对照组,T2、总反应次数、总条件反射率低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。双倍剂量组和模型组仔鼠T1、T2、总反应次数比较差异均有统计学意义(P<0.05);总条件反射率比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组和双倍剂量组仔鼠光密度(OD)值均大于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);模型组仔鼠OD值与双倍剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论孕期感染PolyI:C诱导的子代精神分裂症大鼠表现出行为学改变,同时脑内星形胶质细胞存在异常活化,这可能与子代大鼠的行为学改变有关。

polyI:C诱导人胎盘滋养层细胞抗HBV感染的体外研究

目的:探讨体外polyI:C对人胎盘滋养层细胞乙型肝炎病毒(HBV)感染的作用。方法:将2μg或8μg HBV重组质粒pcDNA3.1(+)-HBV1.3转染人胎盘滋养层细胞Bewo,12 h后以Toll样受体3(TLR3)配体polyI:C处理3天,同时设对照组。采用微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测细胞上清液HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平,并以荧光定量RT-PCR和ELISA分别检测细胞TLR3 mRNA表达及细胞上清IFN-β水平。结果:与对照组比较,polyI:C均可显著抑制Bewo细胞HBV复制(P<0.01或0.05),但与2μg HBV重组质粒转染组比较,转染8μg HBV重组质粒组polyI:C对HBV复制的抑制率显著下降(P<0.01),且polyI:C诱导Bewo细胞TLR3 mRNA表达及IFN-β水平显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:polyI:C可诱导人胎盘滋养层细胞抗HBV感染,但随着HBV感染量的增大,通过下调细胞TLR3 mR-NA表达及IFN-β产生,其抗HBV感染的作用被显著削弱。

Poly I:C对肠炎小鼠肠道黏膜IL-17的影响

目的探讨Poly I:C对肠炎小鼠肠道黏膜IL-17的作用。方法 30只小鼠随机分为Poly I:C组、模型组、正常组,观察各组小鼠一般情况及结肠病理学变化,分光光度计测量结肠组织MDA、MPO的含量,免疫组织化学染色测定结肠组织中TNF-α、TGF-β、IL-17蛋白的表达。结果经Poly I:C治疗后,与模型组比较,小鼠一般情况及结肠病理均有明显改变,Poly I:C组MPO、MDA含量明显下降,模型组MPO、MDA含量明显升高,相比较差异有统计学意义(P<0.01),Poly I:C组结肠组织中TNF-α、IL-17、TGF-β蛋白的染色与模型组比较明显变浅。结论 Poly I:C可抑制肠炎结肠IL-17表达。

聚肌胞苷酸对肺癌细胞A549生长和功能影响

探讨聚肌胞苷酸(polyI∶C)对肺腺癌细胞(A549)增殖、周期、凋亡及γδT细胞对其杀伤活性的影响。用MTT法检测经polyI∶C处理后的γδT细胞和A549的生长抑制率;流式细胞仪检测经polyI∶C处理后A549 TLR3变化及对细胞周期和凋亡的影响;用乳酸脱氢酶释放法测定γδT细胞对经polyI∶C诱导后的A549杀伤活性。肺癌细胞株A549经25μmol/L polyI∶C诱导24 h后细胞凋亡率为(39.44%±4.11%),明显高于对照组凋亡率(28.72%±1.41%)(P<0.05);细胞周期有一定的改变;肿瘤细胞上TLR3表达没有明显变化。A549在25μmol/L PolyI∶C处理后,其与γδT细胞在效靶比为1∶80时杀伤活性明显高于对照组。polyI∶C能抑制A549细胞生长,增加γδT细胞对诱导后的A549细胞杀伤敏感性。

TLR3途径诱导多发性骨髓瘤细胞株增殖抑制和凋亡机制研究

目的研究聚肌苷酸胞苷酸（polyI：C）激活的TLR3通路对多发性骨髓瘤RPMl8226细胞的增殖抑制和凋亡相关的生物学作用及相关机制。方法RPMl8226细胞培养于RPMI1640培养基，以不同浓度的polyI：C与该细胞作用不同的时间。收集细胞后，分别利用CCK-8和流式细胞术分析其增殖抑制和凋亡情况，同时抽提总RNA，相对定量PcR测定TLR3通路相关基因表达。结果PolyI：C对RPMl8226的增殖抑制效应随着作用剂量的增加和时间的延长而增加，24h：12．30％±2．04％、22．50％±2．20％、37．90％±1．30％；48h：17．80％±1．52％、29．60~0．85％、45．80％4-1．68％；72h：25．10％±1．01％、34．60％±1．27％、60．50％±2．080k，差异有统计学意义（P〈0．05）。浓度为50、100、200μg／ml的polyI：c与RPMl8226作用48h后，细胞凋亡率分别为5．60％±1．06％、8．71％±1．06％、13．93％±1．17％，差异具有统计学意义（P〈0．05），而且随着polyI：C作用浓度增加，RPMl8226细胞中TLR3和TRIFmRNA相对于内参B．actin的表达均显著增高，TLR3：1．41±0．10、2．24±0．16、4．08±0．13；TRIF：1．07±0．16、1．97±0．13、3．56±0．19，各组间差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论TLR3途径可以有效地抑制多发性骨髓瘤细胞增殖，并且诱导其凋亡，对多发性骨髓瘤的生物治疗具有潜在应用价值。