西伯利亚蓼不同海拔高度叶片气孔特征比较

为了分析西伯利亚蓼叶片气孔对海拔高度的响应,采用过氧化氢—醋酸离析法,分析观察了不同海拔梯度(2232 m、3660 m、4052 m、4240 m、4444 m)西伯利亚蓼叶片气孔特征。结果表明:在海拔2232 m,西伯利亚蓼叶片上、下表皮气孔外纵径、外横径、外纵径×外横径均为最大,分别为36.43μm、28.10μm、1023.68μm2,37.82μm、24.90μm和941.72μm2(P≤0.05)。随着海拔上升,西伯利亚蓼气孔密度增加,气孔外纵径×外横径降低,是植物适应高海拔环境变化的适应策略的结果。

西伯利亚蓼半胱氨酸合成酶基因的克隆与表达

半胱氨酸合成酶是植物半胱氨酸合成反应的关键限速酶。文中应用RACE技术从西伯利亚蓼中成功克隆了半胱氨酸合成酶基因(GenBank登录号:EU597481),命名为PcCSase1,该基因全长cDNA为1260bp,编码382个氨基酸。经生物信息学分析,初步确定PcCSase1的N端前16个氨基酸为信号肽,并引导PcCSase1蛋白定位于胞质,为胞质型半胱氨酸合成酶。同源序列分析表明,此蛋白与其他植物半胱氨酸合成酶成熟蛋白序列高度保守,氨基酸相似性达到90%左右。荧光定量RT-PCR分析表明,PcCSase1在西伯利亚蓼的叶、茎和地下茎中均有表达,叶中表达最高,茎和地下茎次之,在3%NaHCO3胁迫过程中,该基因在叶、茎和地下茎中均在第2d表达量最高。将PcCSase1转入酿酒酵母INVSc1,结果显示培养基中半胱氨酸和菌体中谷胱甘肽含量均有显著增加,在10%NaHCO3和5mol/LNaCl胁迫下,转基因INVSc1-pYES2-PcCSase1菌株的存活率明显高于对照INVSc1-pYES2,证明PcCSase1基因具有耐高盐的作用。

西伯利亚蓼PsMnSOD基因的耐盐碱性鉴定及其在盐碱胁迫下的表达模式

植物的超氧化物歧化酶的活性与其在盐胁迫下的防御能力密切相关。本文分析了西伯利亚蓼PsMn-SOD基因在酵母中的表达对酵母耐盐碱性的影响以及西伯利亚蓼中PsMnSOD基因在盐碱胁迫下的表达模式。研究结果表明,PsMnSOD基因在酵母中的表达提高了酵母在盐碱胁迫下的SOD酶活性,并提高了酵母对盐碱胁迫的抗性。RT-PCR结果显示,3%NaHCO3胁迫条件下PsMnSOD基因在西伯利亚蓼的叶、茎和地下茎中均有表达,西伯利亚蓼PsMnSOD基因在茎和地下茎中的表达水平高于在叶中的表达水平,叶中PsMnSOD基因的表达水平随着NaHCO3浓度的增加而上升。本试验表明西伯利亚蓼PsMnSOD基因在抵御盐碱胁迫中起到非常重要的作用。

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白编码序列的克隆及其盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein,nsLTP)EST序列,应用RACE技术克隆了具有PolyA的全长cDNA序列.该序列全长604bp,其5′非翻译区65bp,3′非翻译区227bp,开放阅读框编码103个氨基酸残基;序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有nsLTP家族共有的典型保守区域,属nsLTP家族基因,命名为PsnsLTPs;荧光定量PCR分析表明,PsnsLTPs在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达.在3%NaHCO3诱导表达下,该基因在地下茎中表达明显受盐胁迫的诱导,推测该基因在抵御盐胁迫时具有重要作用.

棉花亲环素基因(GhCYP1)克隆及在干旱胁迫下的表达分析

本研究从已构建的棉花(Gossypium hirsutum)干旱胁迫抑制性差减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)cDNA文库分离得到一个含有植物亲环素保守结构域的EST片段,测序并结合cDNA末端快速扩增(5'-RACE)技术获得了1个779bp的cDNA序列。序列分析表明,该cDNA5'非翻译区为70bp,3'非翻译区为187bp,并含有一个编码174个氨基酸蛋白的开放阅读框。Blast分析表明,该基因的编码产物为一个亲环素蛋白,将该基因命名为为GhCYP1,序列提交到GenBank,登录号为GQ292530。半定量RT-PCR分析表明,干旱胁迫处理后,该基因在叶片中的表达量迅速提高,并在胁迫2h达到最高,这一研究暗示该基因的表达与棉花抗旱胁迫相关。

盐胁迫下西伯利亚蓼茎叶正反消减文库的构建及初步分析

正向文库以3%NaHCO3胁迫48h的材料(茎、叶)为实验方(tester),以未胁迫的材料(茎、叶)为消减方(driver);在负向文库中,以未胁迫的材料(茎、叶)为实验方(tester),以3%NaHCO3胁迫48h的材料(茎、叶)为消减方(driver),利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼茎叶正反消减文库。从文库中共获得2282条有效EST序列,其中从茎正向消减文库中获得598条,从茎负向消减文库中获得490条,从叶正向消减文库中获得627条,从叶负向消减文库中获得567条。经BlastX序列比对后,通过MIPs方法对EST功能进行分类并对茎叶正反消减文库做了比较,其中茎与叶部除细胞救援与防御、转运组件中变化趋势相同外,在代谢、能量、光合作用、蛋白合成、转录和信号传导等方面均表现为相反趋势,另外通过荧光定量RT-PCR对12个潜在与盐胁迫相关基因进行定量分析,结果显示12个基因在未经胁迫与盐胁迫处理后的西伯利亚蓼叶与茎部有着很大差异,说明叶与茎部在NaHCO3条件下可能具有不同应答机制与分工,这有助于进一步理解西伯利亚蓼分子耐盐机制。

盐碱胁迫下西伯利亚蓼体内无机离子的变化

研究了碳酸氢钠溶液处理后西伯利亚蓼营养器官内部无机离子含量的变化。实验结果表明碳酸氢钠溶液处理前西伯利亚蓼茎部认为是“K+库”;碳酸氢钠溶液处理过程中“K+库”转变成为“Na+库”,以维持叶部的正常生理功能,并且“Na+库”具有一定的限度;碳酸氢钠溶液处理后,西伯利亚蓼不同部位对外界盐碱胁迫的反应存在多样性。植株在“Na+库”达到限度之前进行旺盛的光合作用,在有限的时间内向地下组织输送更多的有机养分,用以繁殖后代。

西伯利亚蓼多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆及盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼茎抑制消减文库(SSH)中获得的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonase inhibiting proteins,PGIP)的EST序列,采用RACE技术在西伯利亚蓼消减库(SSH)成功克隆了PGIP蛋白基因的cDNA序列.该基因开放读码框为1020bp,编码339个氨基酸,具有1段24个残基的保守亮氨酸结构域.序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有PGIPs家族共有的典型保守区域,属PGIPs家族基因,命名为PsPGIP,GenBank登录号为ACD01043.荧光定量PCR分析表明,PsPGIP在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎等器官中均有分布.在3%NaHCO3诱导表达中,该基因在叶中表达明显受盐胁迫的诱导.推测该基因在抵御盐胁迫伤害中起到了重要的作用.

用SDS—PAGE研究NaHCO_3处理后西伯利亚蓼不同部位蛋白表达的变化

利用酚抽提法分别提取对照、3%NaHCO3处理 5d和 1 0d的西伯利亚蓼地茎、茎和叶部蛋白 ,用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS—PAGE)和分析软件 (Labwork 3.0 )对提取蛋白进行分离和定量分析。结果表明 ,地茎蛋白图谱在 34.1和 2 5 .0× 1 0 3D位置处出现了两条明显受正向调控的蛋白条带 ,茎部蛋白图谱在 5 8.1× 1 0 3D、47.8× 1 0 3D和 9.6× 1 0 3D位置处出现三条正向调控的条带 ,叶组织蛋白图谱在 2 5 .0× 1 0 3D处出现一受正调控的条带。除地茎和叶组织在 2 5 .0× 1 0 3D处同时出现受正向调控的蛋白条带外 ,盐处理后其它组织间表达受正向调控的蛋白条带间存在差异 。

西伯利亚蓼铜伴侣蛋白基因在盐胁迫条件下的表达分析

铜伴侣蛋白是细胞质中负责传递铜离子的一种小分子转运蛋白,在逆境胁迫过程中铜伴侣蛋白的ATX1家族具有消除活性氧的作用.本研究应用RACE技术从西伯利亚蓼中克隆了具有完整编码区的铜伴侣蛋白全长cDNA序列,命名为PsATX-1.PsATX-1基因全长516 bp,其中开放读码框为228 bp,编码75个氨基酸,5′非编码区为83 bp,3′非编码区为204 bp.GenBank中登录号为EU620702.经比对发现,该基因所编码蛋白拥有重金属结合位点MXCXXC,缺少多数高等植物铜伴侣蛋白(CCH)所特有的C末端结构域(CTD).实时荧光定量PCR分析显示,PsATX-1基因在西伯利亚蓼的地下茎、茎、叶中皆有表达,其中叶中表达量最高;PsATX-1基因受3%NaHCO3胁迫诱导,在不同部位表达模式有差异.

青海湖湖滨滩地西伯利亚蓼和水麦冬叶肉细胞超微结构的研究

西伯利亚蓼和水麦冬 2种植物对青海湖湖滨滩地环境的适应 ,反映在叶肉细胞的超微结构上则表现为细胞的形态特征有差异。水麦冬叶肉细胞中 ,叶绿体个别区域或个别细胞的叶绿体基粒类囊体膨大显著 ,个别解体的细胞当中叶绿体基粒内囊体膨大尤为突出 ,这表明 :叶肉细胞叶绿体的类囊体膨大是叶绿体衰老。

西伯利亚蓼甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA克隆与序列分析

根据NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼茎部消减库中甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)表达序列标签序列设计引物,采用cDNA末端快速扩增技术,从西伯利亚蓼茎中扩增出GAPDH的全长cDNA序列。该cDNA序列全长1331bp,完整阅读框1014bp,编码337个氨基酸。属于稳定蛋白,具有GAPDH保守功能域。氨基酸组成与其他已知高等植物来自细胞质中的GAPDH基因cDNA序列具有很高的同源性,最高可以达到96%。通过转酿酒酵母INVSC1的NaHCO3和NaCl胁迫试验表明,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)有明显的抗盐胁迫特性。在10%NaHCO3和4mol·L-1 NaCl胁迫下,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)菌株存活率明显比INVSC1(pYES2)高,可以推测GAPDH基因赋予INVSC1(pYES2-GAPDH)抗NaHCO3和NaCl的能力。该基因的cDNA序列在GenBank中登录号为DQ922680。

西伯利亚蓼解剖结构的扫描电镜观察

在扫描电镜下，观察了盐生植物西伯利亚蓼（Ｐｏｌｙｇｏｎｕｍｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）Ｌａｘｍ．的解剖结构。结果表明：其抗盐碱的主要特征为茎和根中的导管分布率高，导管端壁不具梯状穿孔板，管间纹孔互列式，单穿孔的导管数目多，显示了维管植物较进化类型的输导结构。西伯利亚缪特殊的叶脉，由两个木质部相对排列的维管束组成。这一结构的重演，证实了叶的起源理论。

基于叶绿体trnL-F序列以及matK序列探讨虎杖属与西伯利亚蓼的系统学位置

以蓼科Polygonaceae酸模亚科Rumicoideae酸模族Rumiceae大黄属RheumL.作外类群,对蓼亚科Polygonideae蓼族Polygoneae 4属19种1变种的trnL-F序列以及16种1变种的matK序列进行了测定(部分序列取自GenBank)和聚类分析,探讨了虎杖属Reynoutria Houtt.和西伯利亚蓼Polygonum sibiricum Laxm.的系统学位置,结果表明:(1)虎杖属在两个严格一致树中都聚到了何首乌属Fallopia Adans.的内部,trnL-F序列的支持率为99%,matK序列的支持率为100%,说明虎杖属应归入何首乌属中,所以虎杖属的R.japonica Houtt.与R.sachalinense(F.Schmidt ex Maxim.)Nakai应分别命名为Fallopia japonica(Houtt.)RonseDecraene和F.sachalinense(F.Schmidt ex Maxim.)Ronse Decraene;(2)两个严格一致树都表明,西伯利亚蓼远离蓼属Polygonum L.,聚到了何首乌属的附近,两个序列支持率都为99%,应将该种从蓼属中移出来,提升为属级,即西伯利亚蓼属Knorringia Tzvel.,西伯利亚蓼应命名为Knorringia sibirica(Laxm.) Tzvel.。另外,本文对何首乌属与西伯利亚蓼属作了界定。

储藏方式和时间对三峡水库消落区一年生植物种子萌发的影响

为了明确不同储藏方式和储藏时间对三峡水库消落区4种1年生植物稗(Echinochloa crusgalli)、苍耳(Xanthium sibiricum)、合萌(Aeschynomene indica)和水蓼(Polygonum hydropiper)种子萌发能力的影响,筛选出有利于其萌发的最佳储藏方式及时间,采取5种储藏方式(室温、冷藏、冷冻、干沙、湿沙)、8个储藏时间段(30、60、90、120、150、180、210、240d)对种子进行储藏实验。在光照培养箱昼25℃/夜20℃和周期性光照(昼12h/夜12h,光强100μmol·m-·2s-1)条件下进行种子萌发,每次萌发持续时间为30d。结果显示:(1)稗、苍耳和水蓼的种子在湿沙储藏条件下萌发起始时间缩短,种子萌发率、萌发指数高于其它储藏方式;湿沙储藏条件下,稗的种子储藏90-180d萌发率达到80%以上,苍耳的种子储藏180d萌发率达(64±2)%,水蓼的种子储藏30-240d萌发率均超过90%。(2)冷冻储藏能有效地解除合萌种子休眠,显著提高其种子萌发率和发芽指数;冷冻储藏90-180d合萌的种子萌发率均超过80%,之间没有显著差异。(3)果皮是限制苍耳种子萌发的主要因素之一,而去除果皮对合萌种子萌发没有显著影响。研究结果建议:采用种子来进行消落区植被恢复和重建时,稗、苍耳和水蓼的最佳储藏方式是湿沙储藏,合萌的最佳储藏方式是冷冻储藏。结合三峡水库水位调度原则,在适宜的储藏方式下,本实验中储藏120-180d的种子能够应用于消落区实地播种中。

西伯利亚蓼硫堇基因的克隆和序列分析

根据西伯利亚蓼抑制消减文库(SSH)中获得的硫堇(THI)基因的部分序列,应用RACE技术克隆了具有PolyA的全长cDNA序列。基因全长789bp,5'非翻译区90bp,3'非翻译区276bp,开放阅读框编码140个氨基酸。序列分析表明,该编码蛋白与大多数植物THI蛋白前体高度相似,N端具24个氨基酸的信号肽,中间46个氨基酸为成熟THI部分,C端的70个氨基酸为酸性多肽部分。西伯利亚蓼THI蛋白与丹参等双子叶植物THI蛋白有较高的同源性,具保守的植物THI标签序列C-C-X(5)-R-X(2)-[FY]-X(2)-C。此成熟THI蛋白带正电荷,偏碱性,推定可能具有抗病原微生物活性,为一种新的植物THI蛋白,GenBank登录号为DQ981482。

西伯利亚蓼PsPIP1基因的克隆及其在NaHCO_3胁迫下的表达

应用cDNA末端快速扩增(RACE)技术从西伯利亚蓼叶cDNA文库中克隆了质膜内在蛋白基因(PsPIP1)的完整编码区cDNA序列(GenBank accession No.EU626398),长度为1004bp,编码285个氨基酸。基于和其他植物水通道蛋白的氨基酸序列、推测的三维结构的比较以及系统进化分析结果,初步确定此基因为水通道蛋白基因家族中的PIP1亚族成员。RT-PCR结果显示,PsPIP1在西伯利亚蓼的地下茎、茎、叶中均有表达,叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低。在NaHCO3胁迫与去胁迫的过程中,此基因在地下茎、茎、叶中的表达模式也有较明显的差异。

一种提取植物总RNA的新方法

根据RNA提取的基本原理 ,利用DEPC处理过的去离子水代替CTAB和SDS提取缓冲液 ,成功地提取了小黑杨和西伯利亚蓼的RNA。该方法简单易行 ,是一种提取RNA的新方法 ,同时对该方法的使用提出了建议和要求。

西伯利亚蓼几丁质酶基因Class IV克隆及生物信息学分析

根据西伯利亚蓼抑制消减文库(SSH)中获得的几丁质酶(CHI)基因的部分序列,采用RACE技术克隆了具完整编码区的cDNA序列,基因全长1 017 bp,开放阅读框编码270个氨基酸。序列分析表明,该基因的编码蛋白(PsCHI1)以前体形式存在,N端分别有22个氨基酸的信号肽和35个氨基酸的几丁质结合域(CBD),C端199个氨基酸为催化区(CD),连接CBD与CD的14个氨基酸为可变交联区,成熟蛋白为不含信号肽部分,呈碱性,带正电荷。PsCHI1与所选其它植物classⅣCHI前体序列具有高度的同源性(53%～69%),而与classⅠ和classⅡCHI的氨基酸序列同源性较低,推测为植物classⅣCHI。根据日本水稻CHI晶体结构构建了PsCHI1三维分子模型,分析显示PsCHI1可以识别比classⅠ和classⅡCHI短的几丁质片段,并以其它植物CHI的已知结构域和功能为基础,确定PsCHI1具有能够水解真菌细胞壁的结构,推测其可能有抗病原微生物的功能。

盐胁迫下西伯利亚蓼6个时期混合叶cDNA文库的构建和初步分析

以3%NaHCO_3胁迫处理西伯利亚蓼2 h、6 h、12 h、1 d、2 d和3 d共6个时期混合叶为材料,提取总RNA。根据Stratagene公司cDNA建库试剂盒构建了西伯利亚蓼混合叶cDNA文库。原始文库滴度为2.0×10~6pfu·mL^(-1),扩增后文库滴度为4.5×10~9pfu·mL^(-1),重组率为95.9%,插入片段大小在0.3～1.5 kb之间,平均长度为0.45 kb左右。经测序获得2575个EST序列,拼接出1977个假定独立转录本(TUTs),其中文库中含有大量低丰度表达基因,约占TUTs总数的89.58%。BlastX分析表明,1977个TUTs中共有720个TUTs有明确功能注释,其中参与胁迫过程中代谢、能量、光合作用和蛋白合成基因表达量较高,而涉及转录、信号转导、细胞防御和救援基因表达量较低。