Poly I∶C刺激对裸鼹鼠体内自噬水平的影响

目的 研究多聚肌苷-多聚胞苷酸钠盐（Poly I∶C）对裸鼹鼠自噬水平的影响.方法 成年裸鼹鼠以及C57BL/6小鼠分别随机分成Poly I∶C给药组和对照组,分别腹腔注射Poly I∶C和生理盐水.Poly I∶C给药12h后,组织切片HE染色观察小肠组织的病理变化,电镜观察细胞结构的变化,实时定量PCR检测小肠组织中炎症相关因子IL-1、ATG5的mRNA表达情况,蛋白印迹检测小肠组织中自噬相关蛋白LC3B、Beclin 1表达情况.结果 Poly I∶C给药后,裸鼹鼠小肠组织未出现显著的病理变化,但C57BL/6小鼠小肠组织腺体部出现广泛性出血;电镜观察发现,裸鼹鼠小肠组织细胞中线粒体增多、变长,自噬体数量显著增加,而小鼠组织细胞线粒体有大量的空泡化,滑面内质网扩张;实时定量PCR检测未发现组织中IL-1、ATG5 mRNA表达有显著变化;蛋白印迹检测发现,给药后裸鼹鼠组织中LC3B蛋白表达显著上调（P＜0.05）,而C57BL/6小鼠则下调（P＜0.05）.结论 Poly I∶C给药引起裸鼹鼠自噬水平上调,同时,裸鼹鼠自噬水平的上调亦可以提高机体的适应能力,进而起到抵抗Poly I∶C损伤的作用.

PolyI∶C不同途径诱导大菱鲆Mx蛋白基因的转录

以PolyI∶C(又称聚肌胞)为诱导剂,分别通过腹腔注射、浸泡和投喂3种途径诱导大菱鲆Scophthalmus maximus体内抗病毒蛋白Mx基因的转录,利用半定量RT-PCR方法检测干扰素下游基因-Mx基因的转录水平来确定该诱导剂的诱导效果。结果显示,以上3种途径都能高效诱导Mx蛋白mRNA的转录,均在48h之后达到高峰,其中以浸泡的方式更容易诱导Mx基因转录,且在120h时仍保持较高水平。Mx基因转录的时相变化证明了国产PolyI∶C可以通过多种途径诱导抗病毒蛋白Mx的表达,为实际应用中确定用药途径提供了理论依据。另外,实验初步建立了半定量RT-PCR方法,为检测鱼体内干扰素的表达提供了技术方法。

孕期低剂量poly(I:C)暴露联合新生接种乙肝疫苗诱发小鼠持久性自闭样行为

目的探讨低剂量聚肌苷酸胞甘酸[poly(I:C)]暴露联合新生期乙肝疫苗接种导致小鼠表现出持久性自闭症样行为的机制。方法将孕鼠随机分成4组,分别为对照(CON)组、poly(I:C)(PIC)组、乙肝疫苗(HBV)组和联合免疫干预(P/H)组。4周、8周和12周龄时,检测小鼠自闭症样行为。12周龄时,检测小鼠脾脏Th2、Th17和TH2/17细胞的比例及外周血和海马组织中IL-4和IL-17a的含量。结果与CON组比较,HBV组8周龄时出现行为学损害,12周龄时行为学损害恢复;P/H组8周、12周龄时均出现行为学损害。此外,P/H组较CON组Th2型的细胞水平有升高(P<0.05);P/H组较PIC组Th2型细胞水平升高(P<0.05)。P/H组较HBV组中的Th17型细胞水平升高(P<0.05);P/H组较CON组Th2/17型细胞水平增加(P<0.05);P/H组较PIC组中Th2/17型细胞水平增加(P<0.05)。进一步证实,分别与CON组、HBV和PIC组比较,P/H组血清和海马组织的IL-4和IL-17a的含量升高(P<0.05)。结论孕期低剂量poly(I:C)暴露联合新生期乙肝疫苗接种通过升高脑内IL-17a水平导致小鼠持久性自闭症样行为。

Poly Ⅰ:C刺激对裸鼹鼠和小鼠巨噬细胞PKR/eIF2α信号通路影响的比较研究

目的比较研究聚肌胞苷酸(Poly Ⅰ:C)对裸鼹鼠和小鼠巨噬细胞双链RNA依赖性蛋白激酶R(PKR)/真核细胞翻译起始因子2α(EIF2α)信号通路的影响。方法分别提取裸鼹鼠和C57BL/6J小鼠巨噬细胞,随机分成对照组、Poly Ⅰ:C给药组、2-氨基嘌呤(2-AP)给药组、Poly Ⅰ:C+2-AP给药组。给药后,蛋白印迹检测细胞中磷酸化PKR(Pho-PKR)、PKR、磷酸化EIF2α(Pho-EIF2α)、EIF2α、Caspase-8蛋白的表达情况。结果 Poly Ⅰ:C给药后,小鼠巨噬细胞的PKR和e IF2α磷酸化水平显著降低(P<0.01),而裸鼹鼠相反则显著升高(P<0.01),表明Poly Ⅰ:C能抑制小鼠的PKR活性,而裸鼹鼠的PKR活性被显著激活;Poly Ⅰ:C干预的基础上通过2-AP抑制PKR活性,结果显示,2-AP给药后下调了小鼠和裸鼹鼠PKR和磷酸化PKR的表达(P<0.01),尤其是裸鼹鼠的PKR,2-AP给药后显著地抑制裸鼹鼠PKR的表达;单独2-AP给药后小鼠巨噬细胞的活性PKR和活性eIF2α比例显著下降(P<0.01),裸鼹鼠巨噬细胞的活性PKR比例也显著下降(P<0.01);通过2-AP抑制PKR活性后,裸鼹鼠细胞的Caspase-8蛋白表达水平显著下降,但小鼠细胞的表达却无显著差异。结论与小鼠比较,裸鼹鼠细胞对Poly Ⅰ:C刺激具有较高的抗性;细胞的PKR对2-AP的敏感性更强;PKR活性对Caspase-8表达有促进作用。

聚肌胞免疫刺激下仔猪外周血单核细胞的基因表达分析

聚肌胞(Poly I:C)是一种天然双链RNA(Double strand RNA,dsRNA)的拟似物,能够模拟病毒感染后所形成的dsRNA及刺激机体产生抗病毒免疫反应。文章以抗病力存在差异的大蒲莲和长白仔猪为研究对象,分离外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),在20μg/m L的Poly I:C的免疫刺激下体外培养24 h,对影响免疫应答过程中的7个细胞因子(IRF3、IL6、IL8、IL10、TNFα、IFNγ和IFNα)和3个模式识别受体(TLR3、TLR4和RIG1)利用实时荧光定量PCR检测Poly I:C免疫刺激组相对于对照组的基因表达变化倍数。结果表明:检测的大部分细胞因子和受体(6个)表达量变化倍数很大,其中3种白细胞介素IL6、IL8和IL10免疫刺激变化倍数最大,平均变化倍数分别为20.71、10.87和5.18倍。对不同个体和品种间的比较发现,不仅大蒲莲和长白两品种间(大蒲莲猪的变化倍数平均高于长白猪)而且同品种的3头全同胞仔猪间对Poly I:C免疫刺激的应答也存在较大的变化。文章利用Poly I:C体外模拟dsRNA对PBMC的感染,为下一步筛选仔猪对Poly I:C刺激的免疫应答基因及鉴定大蒲莲猪特殊的抗性基因奠定了基础。

聚肌胞诱导鸡胚成纤维细胞和鸡胚及肉鸡抵抗新城疫病毒感染的研究

为探讨多聚核苷酸(聚肌胞)对新城疫病毒(NDV)的抑制作用,本研究通过聚肌胞对感染NDV的鸡胚成纤维细胞、SPF鸡胚和肉鸡进行了病毒抑制试验。结果显示:125和250μg.mL-1的聚肌胞溶液能明显抑制100倍TC ID50的NDV在鸡胚成纤维细胞上的繁殖;5 mg.mL-1的聚肌胞溶液(每个胚0.1 mL)能明显抑制NDV在SPF鸡胚中的繁殖,减轻NDV对鸡胚生长的抑制作用,降低病毒血凝效价和鸡胚死亡数。聚肌胞对肉鸡抵抗NDV感染试验结果显示,肌肉注射0.01 mg.kg-1的聚肌胞注射液能明显提高治愈率和显效率。但反映细胞活性状态的中性红染色(D570值)随着聚肌胞浓度的增大而变小的结果说明,聚肌胞对鸡胚成纤维细胞的增殖有一定程度的抑制。

桂枝汤含药血清对不同比例Poly(I∶C)-LPS组合刺激肺巨噬细胞的干预效应

目的：基于方证相应原理,旨在探索建立一种模拟病毒-细菌共感染的桂枝汤汤证体外细胞模型,为进一步桂枝汤汤证动物模型的建立积累数据。方法：研究桂枝汤含药血清对不同浓度比例的聚肌胞苷酸[polyinosinic polycytidylic acid,Poly（I∶C）]与脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）混合物刺激的大鼠肺的巨噬细胞（NR8383）Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）及其下游信号转导通路的影响。采用大鼠肺巨噬细胞株NR8383,分别用25,50,100 mg·L^-1的Poly（I∶C）与1,5,10 mg·L^-1LPS刺激NR8383细胞,前者于3,6,12,24 h后取细胞上清,后者于6,12,24,48 h后取细胞培养上清液,酶联免疫吸附测定方法（ELISA）测定炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,白细胞介素-1β（IL-1β）的含量,通过上述2个指标选择Poly（I∶C）与LPS合适的浓度区间与反应的最适时间。利用其Poly与LPS配比为10∶1,20∶1,30∶1,40∶1,50∶1来探讨其对NR8383细胞的TNF-α,IL-1β的含量和TLR-2,3,4,6 mRNA表达的影响,以及桂枝汤含药血清的干预作用,通过上述TNF-α,IL-1β,TLR-2,TLR-3,TLR-4,TLR-6 6个指标对实验结果进行综合评价,筛选刺激效应和桂枝汤干预效应最为明显的Poly（I∶C）-LPS比例。结果：选择刺激时间为6 h,Poly（I∶C）在50 mg·L^-1以下,LPS在1 mg·L^-1时作为合适的刺激浓度。在所用Poly（I∶C）-LPS（10∶1,20∶1,30∶1,40∶1,50∶1）中,与正常组比较,Poly（I∶C）-LPS 50∶1组合刺激效应显著（P〈0.01）,与相对应的模型组比较,桂枝汤含药血清对Poly（I∶C）-LPS 10∶1组合干预效果最为显著（P〈0.01）。结论：Poly（I∶C）-LPS 10∶1刺激NR8383巨噬细胞株NR8383可以作为一种桂枝汤汤证细胞模型,用于桂枝汤及其类方的基础研究。

尼罗罗非鱼干扰素诱导蛋白44基因克隆及表达分析

【目的】探索干扰素诱导蛋白44基因(ifi44)在尼罗罗非鱼各组织的分布特征及其响应无乳链球菌感染和聚肌胞苷酸[Poly(I∶C)]刺激过程中的表达模式,为进一步揭示ifi44基因在鱼类免疫应答中的作用机制打下基础。【方法】克隆On-ifi44基因开放阅读框(ORF),通过ExPASy、TMHMM-2.0、Euk-mPLoc 2.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,根据单细胞转录组测序结果分析On-ifi44基因在细胞层面的分布情况,并采用实时荧光定量PCR检测On-ifi44基因在尼罗罗非鱼各组织中的表达分布特征及在无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后的时序表达情况。【结果】On-ifi44基因ORF序列全长1437 bp,编码478个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为52.7 kD,理论等电点(pI)为4.97。On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域(1~157 aa)和1个GTP-bd结构域(197~322 aa),不含跨膜结构域。On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗非鱼ifi44氨基酸序列的相似性为97.94%;基于ifi44氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示On-ifi44氨基酸序列与奥利亚罗罗非鱼ifi44氨基酸序列聚为一支,二者具有较近的亲缘关系。On-ifi44基因在尼罗罗非鱼的肠道、肝脏、鳃、皮肤、脾脏、体肾、胸腺、脑、头肾、肌肉、心脏等11个组织中均有表达,且主要在T细胞亚群表达;经无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后,On-ifi44基因在尼罗罗非鱼脾脏、肾脏、头肾和肠道组织中的相对表达量均发生变化,且存在明显的时间依赖性。【结论】On-ifi44含有1个TLDc_dom结构域和1个GTP-bd结构域,进化保守且在不同物种间具有相似的生物学功能;On-ifi44基因在无乳链球菌感染和Poly(I∶C)刺激后呈时间依赖性上调表达,表明ifi44基因作为重要的调节因子,参与了尼罗罗非鱼抗细菌感染、抗病毒增殖的免疫应答过程。

皮损内注射聚肌胞治疗寻常疣的临床观察

目的观察皮损内注射聚肌胞治疗寻常疣的临床疗效。方法将60例寻常疣患者随机分为两组,治疗组(30例)采用皮损内注射聚肌胞治疗,对照组(30例)采用液氮冷冻治疗。结果治疗组有效率为86.67%,对照组为53.33%,两者比较差异具有统计学意义(P<0.01);治疗组复发率为3.85%,对照组为31.25%,两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论皮损内注射聚肌胞治疗寻常疣的疗效显著,值得临床推广。

Toll样受体预活化的人脂肪间充质干细胞对人肺癌H460细胞生长的抑制作用

目的观察聚肌胞苷酸[polyinosinic-polycytidylic acid,简称为Poly(I∶C)]和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)预活化后的人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived stem cells,hADMSCs)对人肺癌H460细胞生长的抑制作用。方法利用抽脂手术遗弃脂肪组织标本制备hADMSCs,并鉴定其细胞表面分子标志、细胞增殖能力和体外分化能力;比较Poly(I∶C)、LPS预活化后的hADMSCs细胞表面标志和体外分化能力;ELISA法测定Poly(I∶C)、LPS预活化后的hADMSCs培养基上清中IFNβ的分泌情况;Western blot法分析Poly(I∶C)预活化后的hADMSCs TRAIL的表达情况;用不同浓度Poly(I∶C)预活化hADMSCs后,与不同比例的H460共培养,分析对肿瘤细胞的抑制作用。结果光学显微镜下hADMSCs呈纤维样、鱼群样排列;hADMSCs细胞表面标志CD44、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC的阳性率均大于95%,造血干细胞的特异性标志物CD34、CD45的阴性率均大于98%;Poly(I∶C)和LPS刺激的hADMSCs其细胞表面标志未受影响。Poly(I∶C)和LPS能促进hADMSCs的成骨分化,对成脂分化能力无明显作用。经Poly(I∶C)诱导的hADMSCs分泌的IFNβ浓度明显高于未经诱导的对照组(P<0.05),低浓度的LPS诱导hADMSCs IFNβ表达量不高。Poly(I∶C)预处理促进了hADMSCs表达TRAIL。体外5和25μg/m L的Poly(I∶C)预活化后的hADMSCs对H460细胞表现出细胞毒性,对H460细胞的生长有抑制作用;hADMSCs∶H460比例为1∶2时,对H460细胞的抑制效果最佳。结论成功分离、培养出hADMSCs,其在体外低浓度的Poly(I∶C)诱导下能表达TRAIL,并对H460细胞的生长产生抑制作用。