Monosaccharide analysis and fingerprinting identification of polysaccharides from Poria cocos and Polyporus umbellatus by HPLC combined with chemometrics methods

Objective:Poria cocos and Polyporus umbellatus are similar medicinal fungi in traditional Chinese medicines.A method for fingerprint analysis of monosaccharide composition of polysaccharides by HPLC combined with chemometrics methods has been developed for characterization and discrimination of them in this research.Methods:The polysaccharides were extracted by decocting in water,and then completely hydrolyzed with hydrochloride.Monosaccharides in the hydrolyzates were derivatized with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone(PMP)for HPLC analysis.More than 20 batches of P.cocos and P.umbellatus from different regions were analyzed.Results:The fingerprints of P.cocos showed five common characteristic peaks,which were identified by comparing with the reference substances.The five peaks corresponded to the derivatives of mannose,ribose,glucose,galactose,and fucose.At the same time,the fingerprints of P.umbellatus showed eight common characteristic peaks,of which seven were identified as the derivatives of mannose,ribose,rhamnose,glucose,galactose,xylose,and fucose.Moreover,the similarity of their fingerprints was respectively calculated by the Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM published by China Pharmacopoeia Committee(Version 2004 A).And the data were further processed by hierarchical cluster analysis(HCA)and principal component analysis(PCA).The similarity evaluation and HCA indicated that there were no significant difference in P.cocos or P.umbellatus samples from different geographical regions,but PCA was performed to characterize the difference in monosaccharide constituents between P.cocos and P.umbellatus,and linear discriminant analysis(LDA)showed the overall correct classification rate was 100%.Conclusion:The fingerprint analysis method of monosaccharide composition of water-soluble polysaccharides can distinguish P.cocos and P.umbellatus,and can be applied for the authentication or quality control for P.cocos and P.umbellatus.

一种对猪苓生产具有潜在危害的甲虫分子生物学和形态学鉴定

目的:对宁陕县猪苓栽培过程中影响猪苓产量的一种鞘翅目有害昆虫进行分子鉴定和形态学鉴定,确定害虫的种类。方法:对宁陕县减产猪苓栽培地块昆虫进行采集,使用分子生物学鉴定方法对幼虫和成虫进行DNA提取、细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)序列扩增、测序及BLAST分析,同时使用形态学鉴定方法观察成虫头部下颚、下唇、复眼、触角和结节数量,比对鉴定其种属。结果:成虫和幼虫的分子生物学鉴定结果表明,在进化关系上该虫与鞘翅目中华大扁锹Serrognathus platymelus Saunders的COⅠ序列进化关系最为接近;成虫形态学鉴定结果表明,该虫的雄性头部、胸部、腹部及外生殖器的特征与鞘翅目中华大扁锹吻合;综合判定,该虫为鞘翅目中华大扁锹。结论:鞘翅目中华大扁锹虫害发生可能是导致猪苓产量降低的重要原因,成虫将卵产在朽木内,孵化的幼虫以朽木为食,导致猪苓共生蜜环菌的生长受到抑制,同时幼虫以幼嫩的白苓为食,导致猪苓减产。因此,在猪苓的栽培中应注意该害虫的防治。

发酵法生产猪苓菌丝体及猪苓多糖的研究

采用经选育的猪苓PU 99菌作为生产菌株 ,研究了其培养基组成 ,优化了深层发酵条件。在 1吨罐中生产猪苓菌丝体 :发酵 36h ,其菌丝体干重达 2 .3% ,粗多糖含量为 31.0 %。对得到的猪苓菌丝体进行了有效成分的提取 ,并测定了猪苓多糖的分子量 ,分子量为 2 90 5 4 ,峰面积72 .0 2 %。

猪苓栽培技术研究

由于猪苓的用途不断拓展,野生猪苓的资源濒临枯竭,造成猪苓供需矛盾尖锐。为保护野生资源和缓解猪苓供需矛盾,该文根据猪苓生长适宜条件,摸索猪苓栽培技术,为猪苓人工栽培提供参考。

Box- Behnken响应面法优化猪苓多糖的提取工艺

目的优选猪苓多糖的最佳提取工艺,评价其体外抗氧化活性。方法以猪苓多糖得率为指标,通过超声波辅助提取,以提取时间、液料比和超声功率为影响因素,设计三因素三水平的响应面实验并确定猪苓多糖的最佳提取工艺。此外,通过DPPH自由基清除实验和铁还原实验评价猪苓多糖的抗氧化活性。结果猪苓多糖的最佳提取工艺条件为:超声功率为330 W,液料比为36∶1,提取时间为69 min,提取2次。在此条件下猪苓多糖得率的理论值为4.68%,验证值为4.37%±0.09%。抗氧化实验结果表明,猪苓多糖具有一定的DPPH自由基清除和铁还原能力。结论优选出的猪苓多糖最佳提取条件切实可行,猪苓多糖具有一定的抗氧化能力。

超声法提取猪苓总多糖的工艺研究

目的:优选猪苓总多糖的最佳提取工艺。方法:采用苯酚-硫酸法测定总多糖的含量,以猪苓总多糖的含量为考察指标,对超声法提取猪苓多糖进行了优化研究。结果:最佳提取工艺为取猪苓饮片用14倍量的水超声提取3次,每次20min,浓缩液的醇沉浓度为85%。结论:优选的工艺提取率高,稳定可行。

猪苓挥发油的提取及气相色谱-质谱联用分析

对水蒸气蒸馏提取猪苓挥发油的提取条件进行了研究。获得最佳提取条件为:猪苓粉末(20目)100 g加入1000 mL的水,浸泡1 h后水蒸气蒸馏提取8 h。用气相色谱-质谱联用技术测定了所得猪苓挥发油的化学成分,鉴定出其中22种成分,主要是酮类化合物以及醇类衍生物(47.59%),含量最高的成分分别为2-戊基癸酮(21.37%)、叶绿醇(21.92%)、12,15十入碳二烯酸乙酯(2.67%)、珠光脂酸(2.26%)、1S,2E,4S,6R,7E,11E)-2,7,11-西柏三烯(2.03%)、法尼基丙酮(1.97%)、9,12,15-十八碳三烯酸(1.56%)。

猪苓质量标准的研究

以收集自全国部分省市的20批猪苓药材为试材,参照2010版《中国药典》,通过常规检查、薄层色谱鉴别及有效成分含量的测定,分析优化了猪苓饮片的质量标准,以期为猪苓药材的质量标准制订提供依据。结果表明:20批猪苓药材的有效成分含量及水分、灰分、浸出物含量均存在一定差异;为了更全面地衡量药材质量,建议规定酸不溶性灰分的含量不得超过3.5%,水溶性浸出物含量不低于11.0%,猪苓多糖含量不低于0.50%。

基于柱前衍生UPLC-MS/MS的宁陕地区猪苓单糖组成差异研究

目的:研究宁陕地区猪苓多糖中单糖组成的差异。方法:采用柱前衍生-超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法检测不同生长条件下猪苓多糖中单糖组成及含量。结果:不同生长年限、不同种植地点及地势、种植过程中是否翻窝、不同发育时期的猪苓多糖的单糖组成均存在差异。3年生猪苓相对2年生猪苓,半乳糖、核糖和木糖等9种单糖的含量降低,而葡萄糖醛酸含量增加;黑苓与灰苓中葡萄糖含量差异明显,黑苓葡萄糖含量均值最高可达灰苓的1.9倍;种植过程中不翻窝、选择坡地种植可能有利于猪苓中单糖成分的积累。结论:对宁陕地区不同猪苓样品单糖组成差异进行初步研究,为宁陕地区猪苓的规范化种植提供依据。

药用真菌猪苓细胞凋亡抑制因子基因BI-1的克隆和表达分析

目的克隆药用真菌猪苓Polyporus umbellatus凋亡抑制因子基因BI-1并进行生物信息学和表达模式分析。方法利用5’-RACE PCR方法获取基因cDNA全长;利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域和跨膜结构等分子特性;采用Bioeditor以及MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;实时荧光定量PCR分析基因表达模式。结果猪苓细胞凋亡抑制因子BI-1(Genebank登录号JQ693683)的cDNA全长为1 091 bp,其中编码区占1 005 bp,编码334个氨基酸,推测相对分子质量为36 170,理论等电点为10.51,定名为Pu BI-1。整个多肽链具5个疏水区,表现为疏水性,是疏水性蛋白。系统进化树结果显示Pu BI-1所在分支隶属于担子菌群,与裂褶菌形成一单系。Pu BI-1基因转录本在初始期和生长期表达量在菌核组织中显著高于未形成菌核的菌丝组织,分别为原基期菌核(SI)为3.8倍、发育期菌核(SD)为7.497倍,成熟期菌核和菌丝中的Pu BI-1基因的表达量几乎无差异。结论猪苓凋亡抑制因子基因BI-1的分子特征及表达模式为进一步研究其在猪苓菌丝形成菌核过程中的作用奠定理论基础。

RP-HPLC法测定猪苓中麦角甾醇的含量

目的:建立猪苓药材中麦角甾醇的RP-HPLC含量测定方法。方法:猪苓经甲醇超声提取后,用HPLC测定。采用Dia-mosil C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇;流速为1.0mL·min-1;检测波长为283nm;柱温30℃。结果:麦角甾醇进样量在1.64～16.4μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9997);麦角甾醇的平均回收率(n=5)为98.9%,RSD为1.2%。结论:采用RP-HPLC测定猪苓药材中麦角甾醇的含量,该方法灵敏、快速、准确,可作为2010年版中国药典一部增订猪苓含量测定项。

不同产地猪苓中麦角甾醇含量的比较

比较陕西、山西、云南、四川等地野生猪苓中麦角甾醇含量。野生猪苓样品经甲醇超声提取,用HPLC进行测定。采用Phenomenex C18(250mm×4.60mm,5μm)色谱柱,流动相为甲醇,流速为1.0mL.min-1,检测波长为283nm,柱温30℃。麦角甾醇进样量在0.26—2.64μg范围内线性关系良好(r=0.9999)。平均加标回收率(n=3)分别为102.18%、100.09%、97.84%;RSD分别为4.94%、4.48%、4.24%。测定的18个野生猪苓样品中除个别样地麦角甾醇含量低于2010版《中国药典》规定麦角甾醇最低含量0.05%外,其他均符合药典规定。不同产地猪苓中麦角甾醇含量存在显著性差异(P<0.05),结合野生猪苓形态学记录以及生长环境分析,推测猪苓中麦角甾醇的含量高低可能与猪苓有效生长年龄和密环菌有关,其具体作用机制还有待进一步研究。

经典名方猪苓汤基准样品质量评价方法研究

目的 建立经典名方猪苓汤基准样品的定性和定量检测方法,为其质量标准的建立及复方制剂的开发提供数据支撑和研究基础。方法 建立猪苓汤基准样品HPLC特征图谱,采用国家药典委员会出版的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012年版)计算相似度;确定基准样品含量测定指标成分并通过HPLC建立含量测定方法,进行相关方法学考察;研究建立猪苓汤中处方药味薄层鉴别方法;计算15批基准样品的干膏率及指标成分转移率、水分。结果 特征图谱共标定8个共有峰,分别归属泽泻和阿胶,其中指认3个共有峰,分别为泽泻醇A(峰1)、泽泻醇B(峰2)、23-乙酰泽泻醇B(峰3),15批猪苓汤基准样品质量评价结果表明相似度均大于0.95,可表征猪苓汤基准样品的质量特性;含量测定指标成分确定为阿胶中的L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸,并建立含量测定方法,方法学考察均符合要求;同时建立猪苓、茯苓、泽泻的薄层鉴别方法。计算15批猪苓汤基准样品的平均干膏率为21.53%,平均水分为3.64%,指标成分L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸平均转移率分别为90.89%、90.25%、90.29%、91.28%,所有数据均未出现离散。结论 建立的经典名方猪苓汤基准样品质量标准,能够较全面的反映基准样品关键质量属性,综合体现了处方各药味的信息,为后期经典名方猪苓汤复方制剂的研究提供参考。