来源于线虫Caenorhabditis briggssae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因的合成及其功能分析

ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3PUFAs)是一类被广泛研究和关注的脂肪酸,对人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要,并且对于人类的多种疾病的预防和治疗亦有着明显的作用。在人和哺乳动物体内,ω-3PUFAs的含量与ω-6PUFAs(其代谢方式和功能与前者不同,通常其作用也相反)相比很低。而对于人体,无论ω-3PUFAs的过低还是ω-6PUFAs的过高都会带来极为不利的影响。所以人们一直在努力寻求提高人体中ω-3PUFAs含量的途径或者大量生产ω-3PUFAs的方法。本研究经过密码子优化后,用化学合成的方法获得了C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1-sFat1-EGFP,通过脂质体转染了CHO细胞系并对其进行抗性筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染sFat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的GC-MS分析表明,sFat1基因完全能够在CHO细胞中表达和发挥其ω-3去饱和酶的作用,即促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸(从十八碳到二十二碳)。ω-6不饱和脂肪酸总量从48.97%下降到35.29%,而ω-3不饱和脂肪酸总量则相应地从7.86%上升到24.02%。ω-6多不饱和脂肪酸和ω-3多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.23下降到转染细胞中的1.47。这说明C.briggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1的合成是成功的,试验所获得的结果为今后的进一步的研究或应用其大量生产ω-3PUFAs奠定了基础。

脂肪酸去饱和酶基因的研究进展

多不饱和脂肪酸(PUFAs)对人体有重要的生理功能,脂肪酸去饱和酶是PUFAs合成途径中的关键酶,它控制着PUFAs的不饱和程度。近年来,随着对脂肪酸去饱和酶基因的研究,脂肪酸去饱和酶的研究得到了快速发展。从藻类、真菌、植物和动物等方面简述脂肪酸去饱和酶基因,特别是Δ9和Δ6脂肪酸去饱和酶基因方面的研究近况。

多不饱和脂肪酸与深黄被孢霉低温适应性的关系(英文)

低温生长的适应是一个复杂的过程,涉及细胞的分子生物学和生物化学等很多方面.前期的研究表明,产油真菌——深黄被孢霉（Mortierella isabellina）M6-22能在5-35℃的温度范围生长.本研究以其为研究对象,分析温度下降引起的M6-22细胞膜流动性、多不饱和脂肪酸含量以及多不饱和脂肪酸合成相关基因的mRNA转录水平的变化.结果显示,在15℃条件下,M6-22的细胞膜流动性明显降低,而多不饱和脂肪酸含量显著提高,由30℃时20.85%增加到15℃时的31.04%,而且15℃时Δ^12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA转录水平提高了近3倍,但是Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因mRNA转录水平基本不变.这些研究结果表明,深黄被孢霉M6-22可能通过提高Δ^12-脂肪酸脱氢酶基因的表达水平,增加膜脂中多不饱和脂肪酸含量,维持低温条件下细胞膜的流动性来促进细胞低温环境的适应.本研究将为研究低温条件下多不饱和脂肪酸合成调节机制以及进一步多不饱和脂肪酸工业化生产打下基础.

脂肪酸合成酶系多基因表达载体的构建

目的利用独立表达盒法构建脂肪酸去饱和酶基因和延长酶基因的四基因表达载体进一步研究多基因表达载体中各个基因表达的相互影响。方法利用基因工程的方法扩增2个脂肪酸去饱和酶基因和2个延长酶基因,然后连接到pcDNA3.1(-)哺乳动物表达载体上,之后转化、筛选、酶切鉴定。最后脂质体法瞬时转染HK293T细胞,提取RNA检测这四个基因的表达情况。结果成功构建了含脂肪去饱和酶基因和延长酶基因的四基因表达载体pcDNA3.1-EF,并在HK293T细胞中成功表达。结论四基因表达载体pcDNA3.1-EF在HK293T细胞中成功表达,单个基因在表达载体中的次序对基因的表达没有明显影响。

富含ω-3多不饱和脂肪酸克隆猪制备的关键技术研究

作者综述了制备富含ω-3多不饱和脂肪酸克隆猪的研究意义和国内外的研究现状,并介绍了自己的研究进展。用化学合成的方法获得了Cbriggsae的ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1,并构建了哺乳动物细胞表达载体。通过显微注射的方法制备了转基因小鼠,sFat-1基因能够在转基因小鼠中产生更多更长链的而且更有价值的DHA以及DPA。在确认sFat-1基因功能的基础上,将载体转染到猪胎儿成纤维细胞,利用阳性的细胞克隆通过核移植方式制备富含ω-3多不饱和脂肪酸克隆猪。

食物功能性成分对动物基因组DNA甲基化影响的研究进展

DNA甲基化是表观遗传学的一部分。功能性成分如多酚、黄酮、维生素、n-3不饱和脂肪酸等对DNA甲基化有重要影响。功能性成分主要通过影响甲基转移酶活性和活性甲基基团数量实现对DNA甲基化的影响,结合研究成果阐述多种功能成分:多酚、黄酮、维生素(叶酸、VB12、VB6)、n-3多不饱和脂肪酸等对DNA甲基化的影响和作用机制进行综述,以期为从分子角度探究功能性成分的作用机理提供新思路。

家蚕类ω3-脂肪酸脱氢酶基因的克隆、表达及功能研究

ω3-脂肪酸脱氢酶是生物体内催化多不饱和脂肪酸合成的关键酶之一,其表达受生物胁迫和非生物胁迫因素的影响。从家蚕蛹中克隆了类ω3-脂肪酸脱氢酶基因(Bm FAD3-like),该基因具有一个长度为1 083 bp的开放阅读框,编码由360个氨基酸残基组成的分子质量为41.5 k D的蛋白质。将该基因克隆到p YES2.0载体,构建重组表达载体p YBm FAD3-like及重组酿酒酵母工程菌株YBm FAD3-like后进行诱导表达,收集菌体提取脂肪酸,经气相色谱检测表明异源表达的重组Bm FAD3-like能够将诱导表达体系中加入的外源底物亚油酸(LA)转化为α-亚麻酸(ALA)。半定量RT-PCR检测Bm FAD3-like基因mRNA几乎在家蚕5龄第3天幼虫的所有组织中都有转录,在5龄幼虫期、蛹期和蛾期的转录水平较高,并且其转录水平受低温(0℃)和真菌(球孢白僵菌Beauveria bassiana)侵染(6~36 h)诱导显著上调。对家蚕蛹体注射siRNA沉默目的基因12~72 h后,Bm FAD3-like mRNA转录水平显著下调。研究结果表明,Bm FAD3-like的表达产物能催化LA在ω3位脱氢生成ALA,并且该基因在蚕体受到低温诱导和真菌侵染等胁迫时显著上调表达,外源siRNA能够介导该基因的沉默,显著下调其转录水平。

ω-3脂肪酸脱氢酶基因Fat-1的真核表达载体构建与表达

培养线虫(Caenorhabditis elegans),提取RNA并通过PT-PCR获得其ω-3脂肪酸脱氢酶基因Fat-1,整合入真核表达载体,构建了哺乳动物细胞表达载体pFat-IRES2-GFP,转染牛胎儿成纤维细胞系并对其进行G418筛选获得稳定转染细胞株。对稳定转染Fat-1细胞株的RT-PCR分析及脂肪酸组成的HPLC分析结果表明,Fat-1基因已经整合入牛基因组中,并能够表达和发挥其ω-3脂肪酸脱氢酶的作用,促使-ω6PUFAs转变为相应的-ω3 PUFAs。ω-6脂肪酸总量从35.60%下降到25.47%,-ω3 PUFAs总量从5.75%上升到12.33%,多不饱和脂肪酸的比值从正常细胞中的6.19下降到阳性细胞中的2.07,说明Fat-1基因整合是成功的,能够在细胞中以相应的-ω6 PUFAs为底物合成-ω3 PUFAs。

Fat-1基因及其功能的研究进展

fat-1基因来源于秀丽隐杆线虫C.elegans,翻译产物是ω-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶,此酶的功能是以18-20碳的ω-6 PUFAs为底物进行脱氢反应,生成相应的ω-3 PUFAs,平衡体内ω-6/ω-3 PUFAs的比例,对于预防和治疗心脑血管、肿瘤、精神分裂症等疾病有重要的作用。本文根据国内外对fat-1基因及编码产物的研究现状,分别从它们的结构、作用机制、检测、功能等方面进行了相关的阐述。

多不饱和脂肪酸代谢与动脉粥样硬化的关系

动脉粥样硬化是多因素共同作用引起的,其发病机制复杂,目前尚未完全阐明。多不饱和脂肪酸作为脂肪酸家族中的一员,是哺乳动物生长发育的关键营养物质,其摄入种类和摄入量以及脂肪酸去饱和酶均能影响动脉粥样硬化性疾病的进程。脂肪酸去饱和酶基因簇能够调控脂肪酸去饱和酶的活性并进一步影响动脉粥样硬化。基于代谢和遗传学的观点,本文综述了多不饱和脂肪酸在脂肪酸去饱和酶的调节下对动脉粥样硬化影响的研究进展,并总结了脂肪酸去饱和酶基因簇变异与动脉粥样硬化性心血管疾病之间的关系。

DGLA及ETA合成的多基因植物表达载体的构建

Δ8去饱和酶和Δ9链延长酶是二高-γ-亚麻酸(DGLA)和二十碳四烯酸(ETA)合成的关键酶。本研究利用大豆种子特异性启动子替换35S启动子构建了新的多基因辅助载体PAUX-2,并在此基础上构建了包含来自小眼虫藻的Δ8去饱和酶基因和来自球等鞭金藻的Δ9链延长酶基因的植物表达载体pCambia2300-Δ8Δ9。为进一步利用转基因技术研究这些基因在植物中的表达提供了条件。

大豆ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶基因密码子优化

DHA和EPA对心脑血管疾病以及癌症等疾病的防治有着重要的作用,其中ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶是合成多不饱和脂肪酸DHA和EPA过程中的两个关键的去不饱和酶,由于缺乏这两种酶的基因,高等动物无法自发合成多不饱和脂肪酸,为了得到可以生产多不饱和脂肪酸的转基因动物,本研究计划将大豆的这两个去饱和脂肪酸作为目的基因,但由于不同物种之间的密码子使用具有偏爱性,会严重影响到目的基因在宿主体内的表达水平,为了解决这一问题,提高目的基因在宿主体内的表达水平,同时采用Jcat在线软件和手动替换密码子两种方法对大豆的ω-3和ω-6脂肪酸脱氢酶基因进行了优化,然后选出最优的优化方法,为后期进一步的实验提供目的基因。最后本文预测了两种优化结果的RNA二级结构和CAI、CBI、Nc值和GC含量,比较得出手动替换的结果优于在线优化的结果。

多不饱和脂肪酸与粘红酵母低温适应性的关系

以一株粘红酵母(Rhodotorula glutinis)YM25079为研究对象,分析其低温生长适应性与细胞膜流动性、膜脂脂肪酸含量的变化以及多不饱和脂肪酸合成关键基因——Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA转录水平的关系.结果显示,YM25079在5-30℃温度条件下均能生长,最适生长温度为15℃.在15℃培养条件下,YM25079细胞膜流动性没有明显降低,但是多不饱和脂肪酸含量显著提高,由25℃时29.4%增加到15℃时的55.39%,而且15℃时Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA转录水平提高了5倍.这些研究结果表明,粘红酵母YM25079的低温生长适应性可能是通过提高多不饱和脂肪酸合成相关基因的表达水平,增加膜脂中多不饱和脂肪酸含量,维持低温条件下细胞膜的流动性来形成的.

四个脂肪酸合成酶基因在哺乳动物细胞中的超表达提高长链多不饱和脂肪酸生物合成效率

DHA(22:6n-3)、EPA(20:5n-3)和ARA(20:4n-6)三种长链多不饱和脂肪酸在生物体内活性最强,它们在促进大脑发育和功能维持以及在预防和治疗心血管疾病、炎症、癌症等多种疾病方面有着重要作用。然而,尽管哺乳动物体内有完整的长链多不饱和脂肪酸合成酶系,但哺乳动物合成这些长链多不饱和脂肪酸的效率很低而主要依赖于食物获取。本研究应用转基因方法,将哺乳动物来源的Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶这4种酶的编码基因构建成为一个多基因表达载体,然后转染哺乳动物细胞HEK293T,实现了4个目的基因的超表达,再通过气质联用(GC-MS)分析证实了DHA、EPA和ARA等长链多不饱和脂肪酸的合成效率及水平显著增加,DHA的水平更是提高了2.5倍。由此可见,哺乳动物具有某种抑制长链多不饱和脂肪酸高水平合成的机制,但通过Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶的超表达,能够打破哺乳动物这种抑制机制,从而显著提高DHA、EPA、ARA等的合成水平。同时,本研究的思路也为在转基因动物中生产长链多不饱和脂肪酸提供了重要的启示。

哺乳动物细胞多不饱和脂肪酸合成酶系的重建将亚油酸代谢转变为二十二碳六烯酸

二十二碳六烯酸(DHA,22:6n-3)是一种长度为22个碳原子且含有6个双键的ω-3系多不饱和脂肪酸,在人体中具有重要生物学功能。人体及其他哺乳动物体内只能合成少量的DHA,更多的需求必须从食物中获取。然而,DHA的天然资源(主要是深海鱼类等海洋产品)日趋枯竭,开发新型资源以满足不断扩大的市场需求势在必行。本研究利用转基因技术,在哺乳动物细胞中使Δ6和Δ5脂肪酸去饱和酶以及Δ6和Δ5脂肪酸延长酶超表达,同时表达来源于秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans的Δ15去饱和酶和小眼虫Euglena gracilis的Δ4去饱和酶,结果表明,这6种酶的表达或超表达能将ω-6系的亚油酸(LA,18:2n-6)有效地转化为DHA(22:6n-3),后者的含量从对照组的16.74%提高到实验组的25.3%。本研究的策略及技术路线为将来利用遗传改造的哺乳动物生产珍稀的DHA(22:6n-3)等长链多不饱和脂肪酸产品提供了重要的启示。