抗寒资源枳(Poncirus trifoliata)miR168a克隆、鉴定及遗传转化

基于生物信息学和实验预测,克隆了柑橘抗寒资源枳ptf-miR168a成熟序列和前体序列,并预测了其靶基因。结果表明:ptf-miR168a在植物中高度保守,靶基因是NAC(UCU2)和锌指结构基因(FEZ)家族同源基因;同时,构建了ptf-miR168a前体的超表达载体并在烟草中进行遗传转化,得到了18个转基因系,为进一步鉴定ptf-miR168a在低温胁迫应答中的调控作用奠定基础。

枳NLP转录因子克隆及其在不同水分条件下的表达

【目的】分析柑橘砧木枳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)参与氮素吸收与同化的重要转录因子NLP在干旱胁迫下的表达模式,为柑橘在干旱胁迫条件下对氮素吸收与同化的调控机理提供研究参考。【方法】以柑橘砧木枳为试验材料,在甜橙(Citrus sinensis(L.)Osb.)基因组数据库的基础上,利用生物信息学筛选获得甜橙NLP,并以此设计引物扩增枳NLP的CDS全长并测序。利用Clustal X和MEGA程序进行序列比对和系统发育分析,利用实时荧光定量PCR技术分析不同水分条件下的枳NLP的表达模式。【结果】筛选并克隆获得了4条枳NLP序列,为Pt NLP2、Pt NLP4、Pt NLP7和Pt NLP8。序列比对分析表明枳NLP之间的蛋白质序列一致性为45.13%,均具有明显的RWP-RK和PB1结构域。枳与甜橙的NLP蛋白质序列的一致性极高,分别为97.57%、96.47%、99.0%及97.33%。系统发育分析表明枳NLP可分为4个进化类型,与拟南芥的NLP分类一致,即Pt NLP2与At NLP1/2一类,Pt NLP4与At NLP4/5一类,Pt NLP7与At NLP6/7一类,Pt NLP8与At NLP8/9一类。在不同水分条件下,枳NLP的表达模式在叶与根中存在差异。随着基质水分含量的减少,枳叶NLP呈现先上升再下降的趋势。与对照(相对持水量为61.0%)相比,叶Pt NLP2、Pt NLP4、Pt NLP7及Pt NLP8的表达量在相对持水量为15.4%时上调至最高水平,分别上调了2.9、3.5、5.9及2.8倍,之后持续下调;到相对持水量为9.4%时,其表达水平低于对照但无显著差异。而枳根NLP的表达量在对照中最高,后随着水分的散失呈总体下降趋势且差异显著,与对照相比,根Pt NLP2、Pt NLP4、Pt NLP7及Pt NLP8的最大下调倍数分别为6.7、2.8、4.8及2.3。复水后,枳叶与根NLP的表达量低于复水前,且与对照差异显著。【结论】枳NLP的表达与土壤的水分条件密切相关。枳叶片NLP的表达水平在干旱胁迫前、中期上调,后期下调;而枳根NLP的表达水平在干旱胁迫下持续下调。其中,Pt NLP2和Pt NLP7的表达量在枳根响应干旱胁迫中变化较大。

光照、温度和NaCl胁迫对枳壳种子萌发及幼苗生长的影响

采集未成熟的枳壳[Poncirus trifoliate(L.)Raf.]果实剥取幼嫩种子播种,研究了枳壳种子的萌发情况和幼苗的生长状况。试验设置12个处理,分别为:(1)光照处理:设全光照、光照∶黑暗=12h∶12h、全黑暗3个处理;(2)温度处理:在光照∶黑暗=12h∶12h,设15、25、35℃3个恒温和25℃/15℃(昼夜交替)1个变温,共4个处理;(3)氯化钠(NaCl)胁迫处理:在光照∶黑暗=12h∶12h和25℃条件下,NaCl设置0.0(CK)、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mol/L共6个处理。结果表明,枳壳种子萌发和幼苗生长的最佳处理组合均为光照∶黑暗=12h∶12h、25℃和0.0mol/L的NaCl。

枳NLP转录因子响应干旱胁迫并与NRE顺式作用元件互作

【目的】探讨枳氮素含量在干旱条件下的变化,以及氮代谢途径枳亚硝酸还原酶基因(NiR)和NLP转录因子的响应表达,分析确定枳NLP转录因子与NiR启动子区域硝酸盐响应顺式作用元件(nitrate-responsive cis-element,NRE)位点绑定互作。【方法】以一年生的砧木枳为试验材料,进行干旱处理直至植株叶片开始萎蔫,并设置对照。利用凯氏定氮仪检测干旱条件下枳叶片和侧根的全氮含量,并同步利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和2-ΔΔCT法分析PtNiR、PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8在枳叶片和侧根的表达情况。通过基因克隆并检索与比对分析,获取PtNiR启动子区域的硝酸盐响应顺式作用元件序列,之后利用同源克隆方法构建用于酵母单杂交的pHIS2-4×NRE和p GADT7-Rec-NLP载体,将构建的pHIS2-4×NRE和p GADT7-Rec-NLP载体质粒共同转化到酵母菌株Y187中,在氨基酸缺失培养基(SD/-Trp/-Leu,以及SD/-His/-Trp/-Leu/+120 mmol·L^(-1) 3-氨基三唑)上30℃恒温培养3—5 d,观察酵母的生长情况,以确定枳NLP转录因子(PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8)与NRE的互作关系。【结果】受干旱的影响,枳叶片全氮含量表现出先升高再下降的趋势,而侧根中全氮含量则显著下降;在对照中,枳叶片和侧根全氮含量均显著上升。RT-qPCR分析表明,PtNiR的表达水平在叶片中先上调然后再显著下调,而在侧根中则随着干旱程度的增加显著下调;PtNLP2、PtNLP4及PtNLP7在枳叶片和侧根中的表达也均呈现不同程度的先上调然后再受到抑制的规律,而PtNLP8在枳叶片和侧根中的表达则在一定程度上受到干旱抑制。通过克隆测序分析,在枳NiR启动子区域-196至-154的位置发现了疑似NRE。酵母单杂交分析表明,转化pHIS2-4×NRE-HIS3载体和p GADT7-Rec-NLP载体的Y187酵母在对照培养基(-Trp/-Leu)和含有120 mmol·L^(-1) 3-氨基三唑的三缺培养基(-His/-Trp/-Leu)上均能正常生长。【结论】枳侧根中的全氮含量受干旱的影响而显著下降,以对照为参比,枳侧根和叶片中的全氮含量均随着干旱时间的延长而相对减少。氮代谢途径的枳NiR和NLP转录因子在叶片和侧根中的表达对干旱有不同程度的响应。PtNLP2、PtNLP4、PtNLP7及PtNLP8转录因子均能与PtNiR启动子中的硝酸盐响应顺式作用元件(NRE)位点绑定互作,从而激活下游基因的表达。

缺铁和过量重碳酸盐胁迫下丛枝菌根真菌对枳生长的影响

采用盆栽沙培试验,研究了缺铁及重碳酸盐胁迫下丛枝菌根(arbuscular mycorrhiza,AM)真菌地表球囊霉(Glomus versiforme)对枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]实生苗生长及植株铁营养状况的影响。结果表明,在pH7.0和pH8.0的重碳酸盐胁迫下,与未接种处理相比,接种AM真菌显著增加了枳实生苗的株高、茎粗、地上部和地下部干样质量,并且明显促进了叶片叶绿素和活性铁的积累,显著提高了叶片Fe/P的比值,减轻了枳因缺铁引起的黄化现象。

不同氮素形态对枳橙幼苗生长特性的影响

采用水培方法研究了不同形态氮素配比对枳橙[Citrus.sinensis(L.)Osb×Poncirus trifoliate(L.)Raf]幼苗生长特性的影响。结果表明,不同氮素形态配比营养液对枳橙幼苗的生长均有一定的促进作用,其中混合态氮素对植株地上部形态特征的影响好于单一态氮素,NO3-∶NH4+=5∶5处理更利于株高、茎粗和叶片数的增加;其次是NO_3^-∶NH_4^+=7∶3处理;单一态氮素形态处理中,全硝培养好于全铵培养。NO_3^-∶NH_4^+=5∶5处理促进了地下部主根的伸长和侧根的增加,却对主根粗度无明显影响。全铵培养对幼苗地上部和地下部生长均有抑制作用,甚至是毒害作用。不同氮素形态配比对枳橙幼苗叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量的影响趋势基本一致,混合态氮素对叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总量的促进好于单一态氮素,且当处理为NO_3^-∶NH_4^+=5∶5时叶绿素含量持续增加,并且更利于其积累;而全铵处理则不利于叶绿素的增加与积累。

农杆菌介导的枳壳转化系统建立研究初报

以枳壳为对象 ,进行了农杆菌介导的上胚轴转化系统建立研究 ,得到了携带柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因的枳壳转化植株。研究表明 :枳壳各类外植体中 ,上胚轴是较好的转化材料 ;上胚轴出芽部位主要在形态学上端。以卡那霉素为选择剂 ,外植体水平面放置时 ,选择剂的剂量是 50～ 70mg/ L。转化研究中发现感染液中乙酰丁香酮 10 0μmol/ L的加入促进转化外植体 Gus表达阳性率的提高。延迟 1a的选择培养 ,有助于 Gus阳性芽的增多。所得 Gus阳性无性系经 Southern blot杂交检测 ,证明外源基因已稳定整合到了植物基因组中 ,所得

不同氮素形态培养对枳橙幼苗硝酸还原酶活性及相关基因表达的影响

【目的】进一步探讨枳橙对氮素吸收利用机制,为柑橘生产上提高氮素利用效率和科学施肥提供科学依据。【方法】以枳橙为材料,采用水培方法,在Hoagland配方的基础上进行调节,研究了不同形态氮素配比对枳橙幼苗硝酸还原酶(NR)活性变化及相关基因表达量的影响。【结果】幼苗叶片及根系NR活性均随着培养时间的延长而增加,且叶片NR活性高于根系。其中2号(NO_3^-∶NH_4^+=7∶3)和3号(NO_3^-∶NH_4^+=5∶5)处理的叶片酶活最高;1号(NO_3^-∶NH_4^+=10∶0)和2号(NO_3^-∶NH_4^+=7∶3)处理根系的NR活性显著高于其他处理;进一步研究NR相关基因表达情况表明:3个基因(CitNia1、CitNia2、CitNia OA)在不同处理的枳橙幼苗体内均有表达,其中CitNia1和CitNia2分别是根系和叶片NR相关主效基因,2者均受到NO_3^-、NH_4^+配比诱导,且3号处理(NO_3^-∶NH_4^+=5∶5)下表达量最高。【结论】枳橙幼苗硝态氮代谢的主要部位为叶片,且CitNia2是主效基因,通过调节铵硝比例可以促进其表达。

农杆菌介导枳壳转化系统的建立及PCR鉴定

目的 建立农杆菌介导的枳壳转化体系。方法 以枳壳实生苗上胚轴为转化外植体 ,农杆菌 Ti质粒上插入了外源目的基因——柑桔衰退病病毒外壳蛋白基因 (CTV - cp) ,转化植株用 GUS (β-葡萄苷酸酶 )染色及 PCR进行鉴定。结果 枳壳转化试验中 ,2 0 d苗龄的外植体转化再生率较高 ;外植体与农杆菌共培养时间以 2～ 3d为宜 ;乙酰丁香酮能较大提高转化效率 ,转化再生频率为 2 7.5 %。转化获得的抗性植株中 ,GU S反应呈阳性所占比例为 70 .0 %。 PCR分析证实外源目的基因已整合到枳壳转化株的核基因组中。结论 成功地建立了农杆菌介导的枳壳转化系统 ,为利用基因工程的手段进行枳壳的抗病育种奠定了基础。

杂草发酵物对枳生长和VA菌根形成的影响

在具有高密度VAM真菌生长的枳 (PoncirustrifoliataRaf.)苗的培养土中分别加入 1%的 4种杂草的发酵物 ,70d后测量结果表明 :枳菌根感染率普遍较高 ,但与对照相比 ,杂草发酵物在显著促进枳苗生长的同时降低了枳菌根感染率 ,其中发酵杂草处理对生长的促进作用更大 ,降低菌根感染率更低 ;高氮也降低菌根感染水平 ;过高的菌根感染率导致寄生 。

枳抗寒性相关转录因子CBF启动子缺失表达载体的构建

试验针对枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]CBF启动子序列顺式作用元件预测结果,设计特异引物并PCR扩增分离了元件顺序缺失片段,与基本表达载体pCAMBIA1391Z连接后转化大肠杆菌DH5α,提取质粒DNA后,通过双酶切、PCR及测序筛选出R0-7、R3-10、R4-8、R5-10、R6-10、R7-10和R8-10阳性转化子,成功构建了枳CBF启动子缺失表达载体,为枳CBF启动子顺式作用元件功能验证奠定了基础,为启动子核心元件筛选和转基因高效抗寒柑橘育种提供理论依据。

农杆菌介导的抗菌肽基因转入枳壳影响因素研究

以枳壳上胚轴为对象,进行了农杆菌介导的抗菌肽shivaA基因转化影响因素研究。研究结果表明:枳壳卡那霉素选择浓度为60μg/mL;抑菌抗菌素选用头孢噻肟钠较为合适。农杆菌再悬浮液与共培养基中100μMAs的加入可提高转化频率;延迟选择不利于转化率的提高。所得抗性植株经PCR、Southern检测,证实目的基因已整合到植物基因组中。

土壤未灭菌条件下丛枝菌根对枳实生苗生长和抗旱性的影响

在温室盆栽土壤未灭菌条件下,以枳实生苗[Poncirus trifoliate(L.)Raf.]为试材,研究水分胁迫下丛枝菌根真菌Glomus mosseae对其生长、可溶性糖含量、水分利用效率和制造1 g干物质用水量的影响。结果表明,在正常水分和水分胁迫条件下,丛枝菌根增加或显著增加枳实生苗的生长量,显著或极显著地提高植株的水分利用效率和叶片、根系内的可溶性糖含量,菌根和水分交互影响根系可溶性糖含量,显著降低制造1 g干物质用水量,节约用水28.4％-31.1％,增强了枳实生苗的抗旱性。

不同施肥处理对枳及柠檬容器苗生长的影响

研究9个不同施肥处理对枳及柠檬容器苗生长的影响。结果表明:不同施肥处理对枳容器苗的苗高、地径、分枝高度及嫁接后柠檬苗的发芽率、株高、茎粗、分枝数及生物量都存在显著差异;不同施肥处理对枳及柠檬容器苗综合表现最好的为T4(撒施柠檬专用肥1.6 g)处理,其次是T2(撒施尿素0.6 g)、T3(撒施柠檬专用肥0.8 g)处理,表现最差的是T8(浇施5%柠檬专用肥)和T7(浇施3%柠檬专用肥)处理。在一定施肥浓度范围内,施肥对嫁接后柠檬容器苗的生物量积累有明显促进作用。柠檬容器苗培育时建议采用在基质中撒施柠檬专用肥1.6 g。

枳PPF-1同源基因的克隆及分析

以枳[Poncirus trifoliata(L.)Raf.]实生苗为材料,采用RT-PCR及RACE技术,获得了PPF-1(开花、衰老相关基因)同源基因的cDNA全长序列PtPPF-1,该cDNA全长1 493 bp,编码452个氨基酸,与豌豆PPF-1、拟南芥ALB3、水稻PPF-1及葡萄一未命名基因的氨基酸序列同源性较高,说明PPF-1基因在进化过程中可能变异较小。半定量RT-PCR分析表明PtPPF-1在叶片中表达量最高,顶芽和茎中相似,在根中未检测到,表明该基因功能与叶绿体有关。

丛枝菌根真菌对枳利用难溶性磷酸盐及其生长的影响

在温室沙培灭菌条件下,分别以AlPO4(Al-P)和FePO4.4H2O(Fe-P)为磷源,以枳[Poncirus trifo-liate(L.)Raf.]实生苗为试材,以摩西球囊霉(Glomus mosseae)为菌剂,研究低磷胁迫条件下接种丛枝菌根真菌对枳利用难溶性磷酸盐及生长的影响。结果表明:接种菌根菌显著增加了枳的干重、含磷量及吸磷量;未接种条件下,枳可以利用一定量的Al-P和Fe-P,但更容易利用Fe-P;接种后,枳对Al-P的利用量显著高于不接种的,随Al-P的施用量提高,菌根效应、全株吸磷量、真菌吸磷量及真菌吸磷贡献率显著增加;枳对Fe-P的利用量接种与不接种差异显著,但菌根效应、全株吸磷量、真菌吸磷量、真菌吸磷贡献率及菌根效应均低于Al-P(换算成P2O5)处理;接种处理的基质中有效磷含量显著高于未接种的。

绿衣枳实促胃肠动力有效部位的筛选研究

目的对绿衣枳实促胃肠动力有效部位进行筛选。方法选用系统溶剂对绿衣枳实的醇提液进行萃取分为5个不同极性部位,采用小鼠胃排空及小肠推进试验筛选绿衣枳实促胃肠动力的有效部位。结果乙酸乙酯部位具有明显的促进小鼠胃排空及小肠推进作用。结论绿衣枳实促胃肠动力的有效部位是乙酸乙酯萃取部位。

应用SSH技术鉴定枳抗CTV相关基因

应用SSH技术构建了CTV诱导的枳的正向和反向cDNA文库,经菌液PCR检测,从两个文库中分别随机挑选了100个阳性克隆测序,共获得169条表达序列标签(ESTs).用每条EST序列对应的克里曼丁基因组预测转录序列进行GO功能注释,去除在两个文库中均有出现的ESTs后,共得到与已知基因具有较高相似度,涉及39个特异性表达基因的EST 83条,并对4个特异性表达基因进行了实时定量PCR验证.结果表明:CTV侵染之后,枳启动了相关抗逆防御机制来减少伤害,木质素代谢、RNA干扰、赤霉素、生长素以及光敏色素调控可能在抗CTV中发挥了一定作用.

农杆菌介导的GUS基因在枳壳中的转移

用枳壳 Poncirus trifoliata Raf.实生苗的上胚轴为材料 ,探索以根癌农杆菌介导的 GU S基因在枳壳中的转移 ,结果表明 :抑菌剂选择头孢霉素较好 ;卡那霉素作为选择试剂 ,浓度为 5 0 m g/ L;外植体与农杆菌共培养时间以 2～ 3d为宜。GU S基因瞬时表达检测 ,80 %的外植体呈阳性反应 ;GUS基因稳定表达检测 ,抗性植株中 ,GU S反应呈阳性所占比例为 70 .0 %。

均匀设计在柑橘砧木离体培养再生体系建立中的应用

[目的]建立枳壳离体培养再生体系。[方法]采用均匀设计研究了不同时期枳壳茎尖、茎段、芽的愈伤组织诱导、增殖、分化、及生根情况。[结果]愈伤组织诱导率及生长量由高到低为春梢>夏梢>秋梢>冬梢;不同时期外植体诱导愈伤组织所需生长调节物质种类、浓度、配比不同,春梢茎段外植体诱导愈伤组织以NAA 0.2 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+KT 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L为最好,夏梢茎段外植体诱导愈伤组织以NAA 0.2 mg/L+2,4-D 4.5 mg/L+KT 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L为最好。愈伤组织增殖的最优配方是MT+6-BA 0.25 mg/L+NAA 0.2 mg/L。在MT+6-BA 0.25 mg/L+IBA 0.3 mg/L培养基上不定芽分化效果好,不定根发生率、根数、根的质量均在1/2MT+NAA 4 mg/L培养条件下最佳。[结论]为枳壳快速繁殖、脱毒技术和相关细胞工程的研究奠定基础。