毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4原核表达及蛋白纯化

【目的】对毛果杨半胱氨酸蛋白酶基因Pt CP_2和Pt CP4进行原核表达及重组蛋白纯化,为进一步研究该基因的酶学特征和生理功能打下基础。【方法】从毛果杨中克隆两个半胱氨酸蛋白酶基因Pt CP_2和Pt CP4,构建其原核表达载体p ET-30a-Pt CP_2及p ET-30a-Pt CP4,并在转入大肠杆菌后在体外诱导表达重组蛋白,采用包涵体洗涤法对目的蛋白进行纯化。【结果】Pt CP_2基因CDS序列全长1107 bp,编码368个氨基酸;Pt CP4基因CDS序列全长1104 bp,编码367个氨基酸。Pt CP_2和Pt CP4基因编码的蛋白均属于RD19A-like类型木瓜蛋白酶。Pt CP_2和Pt CP4基因在毛果杨根、茎、叶中均有表达,其中Pt CP_2在叶中表达量最高,Pt CP4在根中表达量最高。通过包涵体洗涤法在体外得到了高表达量、单一的重组蛋白Pt CP_2和Pt CP4,切除信号肽后蛋白酶大小分别为38.151和38.069 k D。【结论】原核表达获得的纯化重组蛋白Pt CP_2和Pt CP4可用于进一步研究毛果杨半胱氨酸蛋白酶的酶学特征和生理功能。

毛果杨PtrAP1-2基因启动子的克隆及其瞬时表达分析

为了研究杨树AP1同源基因的表达规律,利用PCR技术从毛果杨基因组DNA中克隆出PtrAP1-2基因上游一段2103bp序列。联合使用PLACE和PlantCARE在线软件分析序列,结果表明该序列含有TATA-box和CAAT-box启动子基本元件,另外含有MRE、GT1-motif、AE-box、TCT-motif和Box4多种光响应元件,因此,PtrAP1-2可能与植物开花过程紧密相关。在序列分析的基础上,构建了PtrAP1-2基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,命名为PtrAP1-2pro::GUS。利用农杆菌介导的瞬时表达法转化烟草,结果表明PtrAP1-2启动子可以驱动GUS基因在烟草萼片和花瓣中特异表达,在根、茎、叶、雄蕊和心皮等其他组织部位里没有GUS表达活性,这表明PtrAP1-2pro为花器官特异表达启动子。