猪肉及制品中HEV、PEDV和PDCoV三重qPCR方法的建立与应用

人兽共患病引发的动物源性食品安全事件频发,为从食品原料源头上控制和保障其食用安全,控制猪肉及其制品消费成本,本研究构建了可同时检测猪肉及制品中戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪δ冠状病毒(Porcine delta corona virus,PDCoV)三重实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)方法。结果表明,三重qPCR方法只能扩增出3种目的病毒的特异性基因片段,特异性好;对HEV、PEDV和PDCoV三种病毒的最低检测限分别为6.02、6.98、6.92 copies/μL;组内和组间变异系数(CV%)在0.10%~3.00%之间,重复性好。将所建立方法应用于248份出口猪肉及制品和282份生猪粪拭子的检测,同时以相应病毒标准检测方法进行平行检测,结果显示猪肉及制品中三种病毒的检出率均为0%,与标准方法检测结果一致。生猪粪拭子中,该方法对PEDV、PDCoV和HEV三种病毒的检出率分别为1.06%、3.19%、0.35%,标准方法检出率分别为1.06%、3.19%、0%。研究表明,建立的三重qPCR检测方法能准确快速地检测猪肉及制品或生猪样品中三种病毒,为保障生鲜猪肉及其制品市场流通和阻断病毒食源性传播提供技术支持。

PDCoV与TGEV双重实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

试验旨在建立快捷、高效而准确的鉴别诊断猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的双重实时荧光定量PCR方法。通过绘制双重实时荧光定量PCR的标准曲线,检验该方法的特异性、敏感性和重复性,并对临床样品进行检测。结果显示,双重实时荧光定量PCR方法的循环阈值与PDCoV和TGEV质粒拷贝数的对数之间存在良好的线性关系,且对应的相关系数分别为R2(P)=0.9994和R2(T)=0.996;能特异性地检测PDCoV和TGEV,而与PEDV、PRV、PRRSV、CSFV和RV无交叉反应,具有较强的特异性;检验PDCoV与TGEV质粒标准品的最低检测限度分别达到2和20拷贝/μL,且分别比常规RT-PCR高1000和100倍,具有较高的敏感度;PDCoV与TGEV的批内和批间重复性检测的Ct均值基本相同,且变异系数(CV)均<2%,具有较好的重复性。用该方法对114份仔猪腹泻样品检测结果显示,PDCoV和TGEV的阳性率分别为5.6%(6/114)和8.8%(10/114),混合感染检出率为4.6%(5/114),比常规RT-PCR具有更高的检出率和敏感性。结果表明,本试验建立的双重实时荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等优点,适用于病毒早期诊断和批量临床样品检测,为疾病防控、流行病学调查及相关性研究提供了技术支持及数据参考。

4种猪腹泻病毒恒温隔绝式荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒,本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针,经过方阵法优化恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)反应条件,建立了检测这4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法。用建立的iiRT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV),并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果显示该方法特异性强,对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的检测下限分别为10^(2)、10^(2)、10^(3)、10^(3)TCID_(50)/mL,并具有良好的组内和组间重复性;而荧光定量PCR方法的检测下限分别为10^(1)、10^(2)、10^(2)、10^(2)TCID_(50)/mL,敏感性略高于iiRT-PCR。2种方法对22份临床样品的检测结果符合率为100%,PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV阳性率分别为40.91%、9.09%、45.45%、9.09%,其中PEDV与PoRV混合感染率为18.18%,PDCoV与PoRV混合感染率为4.55%。本研究建立的iiRT-PCR为临床现场检测4种猪腹泻病毒提供了一种简便快速的方法。

猪德尔塔冠状病毒病原学特征与致病机制研究进展

猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)作为最近几年新暴发的冠状病毒之一,虽然检出率和致死率低于猪流行性腹泻病毒(PEDV),但感染PDCoV的猪场越来越多,对养殖业造成了严重的经济损失。PDCoV的结构蛋白可能起到免疫调节功能,但目前针对PDCoV病毒蛋白如何调控宿主功能,利用宿主机制逃避免疫反应利于自身存活和增殖的研究较少,对PDCoV各结构蛋白在病毒复制和转录中的具体功能尚无深入研究。文章对PDCoV及其致病机制的研究进展进行综述,以期为基于免疫调节病毒蛋白开发疫苗、通过病毒蛋白直接防控疾病提供参考。

同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的四重实时荧光RT-PCR方法的建立及应用

为实现对猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、猪传染性胃肠炎(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)和猪流性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的同时鉴别检测,根据PDCoV M基因、TGEV S基因、PoRV VP6基因和TGEV N基因保守区域序列合成特异性引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,成功建立了一种可同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光RT-PCR方法。结果显示,所建立的四重实时荧光RT-PCR方法仅对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV出现阳性扩增,与PRV、PPV、PRRSV、CSFV、PCV2等猪常见病原无交叉反应;对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的最低检出限分别为1.17×10^(3),1.13×10^(3),1.31×10^(2)和1.18×10^(2)拷贝;重复性好,组内和组间试验变异系数均小于4.5%。进一步应用所建立的同时检测PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的实时荧光RT-PCR方法对199份采集自河北省不同地区腹泻猪的临床样品进行检测,结果检出23份PoRV阳性(11.56%)、12份PEDV阳性(6.03%)和1份TGEV阳性(0.50%),均为单一感染;未检出PDCoV阳性。本研究所建立的四重实时荧光RT-PCR检测方法可实现对PDCoV、TGEV、PoRV和PEDV的同时鉴别检测,为实验室快速鉴别诊断猪病毒性腹泻提供了有效的技术支持。

猪流行性腹泻或丁型冠状病毒对仔猪生长性能和机体组成的影响

猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪丁型冠状病毒(PDCov)都属于冠状病毒科,它们会引起仔猪腹泻、脱水的临床症状,在某些情况下还会导致死亡。本研究旨在评估PEDV和PDCov对仔猪感染后42 d的生长性能和组织增生的影响。将断奶后14 d、平均体重为(10.82±0.78)kg的225头仔猪随机分为3组,每组5个重复,每个重复15头,对照组不做任何处理,PEDV和PDCov组分别接种PEDV和PDCov病毒。结果:对照组RT-PCT结果均显示阴性,而接种后3 d PEDV和PDCoV组猪的感染率最高。对照组和PDCov组较PEDV组末重显著提高了18.33%和22.60%(P<0.05)。对照组和PDCov组感染后0~7 d平均日增重较PEDV组分别提高了345.45%和300%(P<0.05),PDCov组0~7 d平均日采食量较PEDV组显著提高了47.92%(P<0.05),8~14 d平均日采食量较对照组和PEDV组分别提高了36.23%和42.42%(P<0.05)。对照组和PDCov组0~7 d饲料报酬较PEDV组显著提高了446.15%和423.08%(P<0.05),而对照组和PEDV组感染后15~21 d饲料报酬分别较PDCov组提高了59.52%和59.52%(P<0.05)。对照组和PDCov组较PEDV组显著提高了期末脂肪、瘦肉、蛋白质、体重、骨矿物质和骨密度(P<0.05),但PEDV组瘦肉:脂肪值较PDCov组显著提高了12.92%(P<0.05)。结论:在本研究条件下,只有感染PEDV的猪在42 d出现组织增生和采食量降低情况。

PDCoV、SADS-CoV与SVA三重RT-PCR检测方法的建立与应用

【背景】猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展。猪感染这3种新发病原难以根据临床症状诊断,因此亟须建立多重反转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测方法对疑似患病猪进行快速诊断,以降低经济损失。【目的】建立能同时检测PDCoV、SADS-CoV和SVA单一或混合感染的三重RT-PCR检测方法。【方法】参考GenBank中登录的PDCoV和SADS-CoV N基因、SVA L/P1基因保守区域序列设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm);采用方阵法优化其引物浓度;构建重组质粒PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV和PMD-SVA作为标准品确定最小检测量;以猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒等6种常见感染猪的病毒核酸样本为模板,确定三重RT-PCR法的特异性;以批间和批内试验验证其重复性;经检测临床样本并与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。【结果】建立的三重RT-PCR检测方法最佳退火温度为58.3℃,引物最佳浓度分别为0.50、0.25和0.25μmol/L;其敏感性高,PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV与PMD-SVA最低检测限分别为1、1和10 copies/μL;其特异性强,仅对PDCoV、SADS-CoV和SVA有特异性条带,对其他病毒均无扩增条带;该方法重复性好,批间和批内试验检测结果均一致。最后经临床样本检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的阳性率分别为4.4%、0%和0.73%,与已报道的检测方法一致。【结论】建立了一种能够同时快速检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的三重RT-PCR方法,为临床上检测上述3种病毒提供了技术支撑。

重组酶聚合酶扩增技术快速检测猪肉及其制品中ASFV、PDCoV和SVA

目的建立非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)和A型塞内卡病毒(SVA)多重重组酶聚合酶扩增(RPA)快速检测方法。方法以重组质粒为模板进行RPA检测,并优化温度、时间、引物探针配比等反应条件,建立多重RPA检测方法,应用于实际样本的检测;与实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)结果对比,评价所建立方法的准确率。结果本方法可在20 min内实现对3种病毒的同时检测,特异性良好;对ASFV、PDCoV、SVA灵敏度分别为940、770、570 copies/μL;用于实际核酸样本检测,准确率分别为93.33%、100.00%、100.00%。结论本文建立的多重RPA方法快速、便捷,适合猪肉及其制品中ASFV、PDCoV、SVA的现场初筛。

一种鸡抗猪丁型冠状病毒阳性血清的制备方法

为研究用鸡制备猪丁型冠状病毒(PDCoV)阳性血清,将PDCoV用二乙烯亚胺(BEI)灭活,加矿物油佐剂乳化制成疫苗,多次免疫SPF鸡,采集血清,检测血清中和效价并用间接免疫荧光法(IFA)检测PDCoV。结果显示,血清中和效价随免疫次数增加逐渐增高,4免后14 d的中和效价平均值为1314;制备的阳性血清可用于IFA检测PDCoV,其不与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)反应,特异性良好。本研究用鸡成功制备PDCoV阳性血清,为利用鸡制备其他猪病阳性血清奠定基础。

新发猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

猪Delta冠状病毒（porcine delta coronavirus，PDCoV）是一种新发现的仔猪腹泻类冠状病毒，感染仔猪主要表现出水样腹泻、呕吐和脱水等临床症状，和猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）临床症状极其类似，且I临床上混合感染病例较多，单靠临床症状和剖检变化很难辨别这2种疾病，因此建立同时检测且能区分PDCoV和PEDV的检测方法具有重要意义。参照GenBank登录的PDCoVM基因和PEDVORF3基因特异性序列设计引物，扩增相应的基因片段，克隆构建重组质粒pMD-18T—PDCovM与pMD-18T—PEDVORF8，测序验证后，分别以此重组质粒为标准品，建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBRGreenI双重荧光RTPCR方法，并对其扩增体系和扩增条件等进行了优化，同时对所建立的双重荧光RT—PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行了检测。结果显示，该试验成功建立了能同时检测PDCov和PEDv的SYBRGreenI双重荧光RTPCR方法，最低能检测到PDCoV和PEDV分别是28．6拷贝/μL和99．6拷贝/μL的质粒浓度，显示出较好的敏感性；在同样扩增条件下该方法具有较好的重复性；特异性试验表明，该方法仅能检测出PEDV和PDCoV，而对猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪伪狂犬病毒（PRV）等均不产生特异性扩增曲线。将所建立的双重荧光RTPCR方法以及单重荧光定量RT—PCR方法分别对198份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV和PD—CoV检测，结果显示，PDCoV阳性样品41份，阳性率为20．7％；PEDV阳性样品59份，阳性率为29．8％；同时感染这2种病毒的样品17份，阳性率为8．6％。与单重荧光定量RT—PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一样，符合率100．0％。本研究成功建立了PDCoV和PEDV的双重荧光RT—PCR方法，能同时准确地检测PDCoV和PEDV，这为PDCoV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定基础。

猪δ冠状病毒感染猪树突状细胞及对免疫因子分泌能力的影响

以猪树突状细胞(porcine dendritic cells,pDCs)为模型,探究猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是否能够对pDCs进行有效感染及对抗病毒细胞因子分泌的影响。采集猪外周抗凝血,分离获得猪外周血单核细胞,经白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)和集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)诱导培养获得未成熟树突状细胞,利用倒置显微镜和透射电镜观察其生物学形态,通过蛋白质免疫印迹和激光共聚焦试验检测病毒是否可以对pDCs进行感染,qRT-PCR检测抗病毒因子IFN-α和ISG56的表达。结果显示,成功分离培养得到具有典型树突状细胞形态的pDCs,将PDCoV接种至分离培养得到的pDCs中,PDCoV可以有效感染,可以在pDCs中进行复制并产生感染性的子代病毒颗粒,病毒滴度达到4.4 lgTCID50/0.1 mL。同时检测PDCoV感染pDCs时对抗病毒因子表达的影响,结果表明,在病毒感染pDCs后48 h产生了高水平的IFN-α和ISG56。本研究成功诱导培养得到pDCs,首次证实PDCoV可以在体外感染pDCs,并在细胞中进行有效地复制,pDCs在病毒感染后促进IFN-α、ISG56的分泌来发挥抗病毒免疫效应,为后续研究PDCoV的致病机制提供了新的思路。

PDCoV、SADS-CoV与SVA三重RT-PCR检测方法的建立与应用

【背景】猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)、新型猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)与塞内卡病毒A型(Seneca virus A,SVA)均为猪的新发病原,严重危害养猪业的发展。猪感染这3种新发病原难以根据临床症状诊断,因此亟须建立多重RT-PCR检测方法对疑似患病猪进行快速诊断,以降低经济损失。【目的】建立能同时检测PDCoV、SADS-CoV和SVA单一或混合感染的三重RT-PCR检测方法。【方法】参考GenBank中登录的PDCoV和SADS-CoV N基因、SVA L/P1基因保守区域,设计3对特异性引物,以温度梯度PCR法确定最适退火温度(Tm);采用方阵法优化其引物浓度;构建重组质粒PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV和PMD-SVA作为标准品确定最小检测量(limits of detection,LOD);以猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等6种常见感染猪的病毒核酸样本为模板,确定三重RT-PCR法的特异性;以批间和批内实验验证其重复性;经检测疑似感染的临床样本并与已报道的检测方法进行比较,评估其临床应用效果。【结果】最佳退火温度为58.3℃;引物最佳浓度分别为0.5、0.25和0.25μmol/L;其敏感性高,PMD-PDCoV、PMD-SADS-CoV与PMD-SVA最低检测限分别为1、1和10 copies/μL;其特异性强,仅对PDCoV、SADS-CoV和SVA有特异性条带,对其他病毒均无扩增条带;该方法重复性好,批间和批内实验检测结果均一致。经临床样本检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的阳性率分别为65.85%、30.49%和57.32%,与已报道的检测方法一致。最后从13份PDCoV、SADS-CoV和SVA均为阳性的样品中随机选取5份样品进行测序,并做同源性及进化树分析,结果显示5份阳性病料的PCR扩增序列之间相似性较高,而且和参考序列之间也具有较高的相似性,均可达到96%以上。表明本研究建立的方法在应用于临床样品检测中具有较高的准确性和可靠性。【结论】建立了一种能够同时快速检测PDCoV、SADS-CoV和SVA的三重RT-PCR方法,为临床上检测上述3种病毒提供了技术支撑。

3种猪腹泻相关病原核酸液相芯片检测方法的建立

为建立同步检测猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪Delta冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)3种腹泻相关病原体的快速高通量检测方法,本研究利用Lumeinex技术原理,建立三重液相芯片方法。结果显示,该方法可准确检出TGEV、PEDV和PDCoV 3种猪腹泻病原,与猪轮状病毒、口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、非洲猪瘟病毒等常见猪病病原无交叉反应;三重液相芯片方法对TGEV、PEDV和PDCoV核酸的检测灵敏度分别为33.2 pg/μL、163 pg/μL和12.1 pg/μL。应用该方法与荧光RT-PCR方法对52份临床样品同时检测,结果符合率为100%。研究结果表明,所建立的三重液相芯片方法可准确检测TGEV、PEDV和PDCoV,具有良好的特异性和敏感性。