Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus in Guangxi Province from 2011 to 2014 and Sequence Analysis of Its M Gene

Detection of pigs epidemic diarrhea virus （PEDV） was conducted on 331 piglets diarrhea fecal samples collected in Nanning, Yulin and other 12 areas of Guangxi Province from January of 2011 to April of 2014 by the method of reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. The results showed that the positive samples of PEDV were 210 and the positive rate was 63.44%. The clone and sequencing of M gene was carried out on 25 positive samples. PEDV reference strains were selected from GeneBank to conduct the sequence homology alignment analysis and the phylogenetic tree of M gene. The M gene homology and amino acid sequence identity between 25 isolated strains and 51 reference strains were 96.0% - 99.6% and 94.3% - 99.6%, respectively. The genetic variation anal- ysis of M gene showed that the genetic relationship of PEDV prevalent strains in Guangxi Province from 2013 to 2014 was close to that of the prevalent strains in Bei- jing, Anhui, Wuhan, Hebei and Guangdong from 2010 to 2013, and which were far from that of the Chinese early isolates CH/S （GenBank number： JN547228 ）, vaccine strain CV777 （GenBank number： AF353511 ） and Attenuated DR13 （GenBank number： JQ023162）. Indicating that the PEDV strains prevalent in Guan- gxi in recent years showed significant variation with the early isolates.

2011年-2014年广西猪流行性腹泻病毒检测及其M基因的序列分析

本试验应用RT-PCR方法对2011年1月—2014年4月采自广西南宁、玉林等14个地区的331份仔猪腹泻粪便样品进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）检测。结果显示331份样品中有210份为PEDV阳性,阳性率为63.44%。对其中25份阳性样品的PEDV M基因进行克隆和测序,将测序结果与GenBank中PEDV参考毒株的M基因序列进行同源性比对分析并构建系统进化树。25个PEDV M基因序列与51个参考毒株M基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.9%、94.3%~99.6%。PEDV M基因遗传变异分析结果表明,广西2013年—2014年的PEDV流行毒株与北京、安徽、武汉、河北、广东等地2010年—2013年的流行毒株亲缘关系较近,而与中国早期分离株CH/S（GenBank登录号：JN547228）、疫苗株CV777（GenBank登录号：AF353511）和Attenuated DR13（GenBank登录号：JQ023162）的遗传距离较远。提示广西现流行的PEDV与早期毒株相比已发生较为明显的变异。

猪流行性腹泻病毒PCR检测及其M基因的遗传变异分析

为了解我国猪流行性腹泻病毒(PEDV)的流行情况,利用套式反转录-聚合酶链反应(nRT-PCR)技术,从表现腹泻症状的仔猪粪便中扩增出6份阳性样品,测序表明,一扩PCR产物的大小为854bp,涵盖PEDV的M基因。选择34个参考毒株基于M基因进行进化树分析,结果显示PEDV可以分为G1和G2两个基因型7个基因亚型。G1型以2007年前的经典毒株为主,包括CV777、Br1/87、KPEDV-9、JMe2和CH/S株等;G2型则以近年分离的毒株为主,包括GDXS5、JS-2004-2、PFF188、KU06RB08等。其中G2.3亚型已经成为目前世界上主要的PEDV流行毒株,包括本次检测的6株PEDV、泰国的KU06RB08及GenBank中我国和韩国2011年的流行毒株。通过同源性比较发现,这6株PEDV之间的同源性为98.2%～100%,与经典毒株CV777的同源性为97.6%～98.2%。结果表明,尽管PEDV之间的同源性仍较高,但PEDV流行毒株已经逐渐形成独特的流行进化分支。

猪流行性腹泻病毒ORF3和M基因的克隆与序列分析

为了解福建省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)毒株ORF3和M基因变异情况,本研究从4个不同规模猪场发生仔猪"顽固性腹泻"疾病的病料中扩增到4株PEDV的ORF3和M基因,并进行了序列分析。结果表明:4株PEDV ORF3基因均含有675个碱基,编码224个氨基酸,与GenBank中登录的代表性PEDV核苷酸的同源性为89.7%～100.0%,氨基酸的同源性为94.7%～99.6%,其中FJPT毒株核苷酸的同源性与CV777 truncated毒株最低,仅为89.7%,FJNP毒株核苷酸的同源性与中国北方流行的CH ZKFG 11毒株最高,达100.0%。M基因含有681个碱基,编码226个氨基酸,与GenBank中登录的代表性PEDV核苷酸的同源性为94.8%～100.0%,氨基酸的同源性为94.8%～99.6%,其中FJPT毒株核苷酸的同源性与日本D89752毒株最低,仅为94.8%,FJNP毒株核苷酸的同源性与韩国CPF193、泰国毒株最高,达100.0%。4株PEDV毒株均与国内外流行强毒株的亲缘关系较近,与attenuate DR13弱毒株的亲缘关系较远。

贵州省猪流行性腹泻病毒ORF3、M基因克隆及序列分析

为了解贵州省猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）毒株ORF3及M基因的遗传变异情况,试验于2014年4月-2015年3月从贵州省5个地区采集105份腹泻仔猪的粪便,应用RT-PCR方法进行PEDV检测,从中选择8份PEDV阳性样本,扩增其ORF3及M基因,测序并进行序列比对分析。结果显示,从采集的105份粪便样本中可检出75份PEDV阳性样本,阳性率为71.43%;8株PEDV贵州株ORF3及M基因序列均无碱基缺失或插入;ORF3基因核苷酸及推导的氨基酸同源性在95.1%-100.0%与95.1%-99.6%之间,M基因核苷酸及推导的氨基酸同源性在98.4%-100.0%与98.7%-100.0%之间;氨基酸系统进化树分析结果显示,2014-2015年贵州流行株与近年来中国毒株、韩国毒株及泰国毒株亲缘关系较近,与疫苗株Attenuated DR13及CV777株亲缘关系较远。提示目前贵州省仔猪腹泻病原主要是PEDV,且为PEDV强毒株。

变异猪流行性腹泻病毒M和N双基因融合真核表达及其活性鉴定

【目的】体外表达变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M-N双基因融合蛋白并明确其生物活性,为开展PEDV新型疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白。【方法】将变异PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2(pM2)真核表达载体构建pM2-M真核质粒,通过同源重组将N基因克隆至M2-M基因片段构建pM2-M-N双基因融合重组质粒,然后转染293T细胞表达出M-N双基因融合蛋白。通过Western blotting、ELISA及免疫BLAB/c小鼠试验鉴定表达融合蛋白的生物学活性。【结果】扩增获得的M基因、N基因片段大小分别为678和1359 bp,且与原序列的相似性均达100.0%。将M基因和N基因并连接至pM2真核表达载体成功构建获得pM2-M-N双基因融合重组质粒,M-N双基因片段大小为2004 bp,且与原序列的相似性为99.3%。以pM2-M-N双基因融合重组质粒转染239T细胞,表达出大小约75 kD且具有免疫活性的M-N双基因融合蛋白,纯化的M-N双基因融合蛋白能与PEDV阳性血清反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒均无交叉反应;以其免疫BLAB/c小鼠能诱导产生特异性抗体。【结论】通过pM2真核表达载体能构建获得变异PEDV毒株的pM2-M-N融合双基因重组质粒,转染293T细胞后可表达出具有良好免疫活性的M-N双基因融合蛋白,为后期开展变异PEDV基因工程疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白。

变异猪流行性腹泻病毒M和N融合双基因的原核表达及表达产物免疫原性分析

旨在构建变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M和N双基因融合质粒,并分析表达蛋白免疫原性。通过扩增变异PEDV FJFQ2014毒株(GenBank登陆号KJ646580)的M基因和N基因,将M基因克隆至pEASY-Blunt E2(pE2)表达载体,构建出pE2-M质粒。利用同源重组原理,采用无缝拼接试剂盒将N基因克隆至E2-M片段,转化到Trans 1-T1感受态细胞中,构建出pE2-M-N融合双基因质粒并转化Transetta(DE3),表达出相应的融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot验证蛋白的表达情况。将纯化的M-N融合蛋白皮下接种BLAB/c小鼠,通过ELISA方法检测融合蛋白的免疫原性。结果表明:扩增出M和N基因,成功构建了pE2-M质粒,并将E2-M基因与N基因进行有效连接,构建出pE2-M-N融合双基因质粒,表达出了具有免疫原性的M-N融合蛋白,该蛋白能够诱导小鼠产生相应的特异性抗体。变异PEDV的pE2-M-N双基因融合质粒的构建,为进一步开展变异PEDV的诊断技术和免疫学等研究,奠定良好基础。

猪流行性腹泻病毒贵州株的分离及M基因序列分析

为了解猪流行性腹泻病毒(PEDV)在贵州地区的分子流行病学、遗传变异及其防治提供参考,从贵州省某猪场腹泻仔猪的粪便中分离出1株PEDV(GZ-ZY株),同时对M基因进行了扩增、克隆及序列分析。结果表明:分离毒株在Vero细胞上盲传至第5代时出现以合胞体为特征的细胞病变;M基因大小为681bp,可编码226个氨基酸,核苷酸序列与疫苗株CV777的相似性为98.1%,氨基酸相似性为98.2%,推导的氨基酸位点在第13位由谷氨酸(Glu)变为谷氨酰胺(Gln),第42位由缬氨酸(Val)变为丙氨酸(Ala),第214位由丙氨酸(Ala)变为丝氨酸(Ser)。PEDV的M基因高度保守,是PEDV遗传演化的重要候选基因。

闽西地区猪流行性腹泻病毒M基因遗传进化及分子结构特征分析

为了解2015—2017年闽西地区猪流行性腹泻病毒(PEDV)遗传进化规律,本研究收集了闽西地区12份PEDV阳性样品,对其M基因进行RT-PCR扩增,克隆至p MD18-T载体测序,并与国内外已知参考毒株序列进行比对及遗传进化分析。结果表明,12株闽西毒株M基因氨基酸序列同源性为100.0%;遗传进化分析表明,12株闽西毒株与经典毒株CV777、2010年前中国分离毒株LCZ、以及韩国毒株SM98、virulent DR13的亲缘性较远,而与2010年后国内分离毒株以及2013年美国分离毒株亲缘关系最近,说明闽西PEDV毒株属于目前国内外流行毒株。分子结构特征分析表明,PEDV M基因具备高度保守的特性,可以作为设计疫苗的候选基因。

猪流行性腹泻病毒5株安徽流行株M基因的克隆与序列分析

为了解安徽省猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的遗传变异,对5株PEDV安徽流行株M基因进行RT-PCR扩增、序列测定和分析。结果表明,5株PEDV安徽流行毒株M基因的全长均为681bp,编码226个氨基酸,核苷酸同源性为99.1%~99.9%,其与国内外PEDV参考毒株核苷酸同源性为96.9%~100%。进化树分析显示,5株流行毒株与CV777、attenuatedDR13、LZC和CHS亲缘关系较远,与2011年后国内外PEDV分离株的亲缘关系较近。

猪流行性腹泻病毒E和M基因的克隆及变异分析

为了解2012-2014年福建省流行PEDV毒株E和M基因的变异情况,对19株PEDV的E基因和18株PEDV的M基因进行克隆和序列分析。结果表明：与CV777标准毒株相比较,福建流行PEDV毒株的E和M基因存在编码的部分氨基酸变异。19株PEDV E基因的核苷酸之间的同源性为97.4%-100.0%,与attenuated DR13弱毒株和CV777标准株同源性分别为97.4%-100.0%和97.0%-99.6%。18株PEDV M基因的核苷酸之间的同源性为97.4%-100.0%,与attenuated DR13弱毒株和CV777标准株同源性分别为97.2%-99.6%和97.5%-98.4%。核苷酸遗传进化树表明福建流行PEDV毒株的E基因与CV777亲缘关系较近,而M基因与2008年泰国流行的KU05CB08毒株亲缘关系较近,是个新的基因型,可能源于泰国。

猪流行性腹泻病毒山西分离株M基因序列分析

为了研究山西地区猪流行性腹泻病毒M基因的遗传变异情况,从2014年10月~2015年4月山西地区11个地市收集的猪流行性腹泻病毒(PEDV)病料中扩增到4株PEDV的M基因,并进行序列比对及遗传分析。结果表明,4株PEDV的M基因与CV777毒株比较,部分核苷酸及氨基酸发生改变。4株PEDV的M基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.6%~100%和99.1%~99.6%,与参考毒株的核苷酸和氨基酸的同源性分别为96.3%~99.9%和96.0%~99.1%。遗传进化分析显示,4株PEDV与2010-2013年中国分离株(BJ2010、HB/BD、HB/FN、HLJ-2012、GDHZ-1202、SHQP/YM/2013)、2008年泰国KU04RB08株亲缘关系较近;与2株泰国株(M_NIAH2013_95和M_NIAH1795_04)、2株欧洲株(CV777和Br1/87)和2006年中国分离株LZC亲缘关系较远。

2013-2014年黑龙江地区猪流行性腹泻病毒检测及M基因的遗传进化分析

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种严重的病毒性传染病。本试验于2013 2014年在黑龙江省6个地级市的10个规模化猪场采集新生哺乳仔猪临床表现为腹泻症状的粪便与小肠,进行RT-PCR检测,表明PEDV检出率为56%,PEDV+TGEV检出率为6%,PRV检出率为10%,TGEV检出率为10%,结果表明,引起黑龙江省规模化猪场新生仔猪腹泻的主要病原是PEDV,同时也存在与其他腹泻病毒的混合感染。针对阳性病料扩增出的6株PEDV的M基因序列进行遗传进化分析,6株PEDV-M基因序列之间的核苷酸同源性为98.2%~99%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为97.6%~98.2%。利用MEGA 6.0构建遗传进化树,结果显示,扩增出的6条PEDV-M基因的遗传进化树分为两大系,大部分遗传距离较近,处于同一分支。其中LJJHD-M-13和LJJQ-M-14与泰国KU06RB08、泰国KU07RB08的亲缘关系较近,LJJC-M-14、LJJJ-M-14、LJJH-M-13、LJMM-M-14这4株毒株与韩国M1595、韩国CPF259的亲缘关系较近。同时扩增出的6条PEDV-M基因与CV777毒株非一系,与其亲缘关系较远,说明这些地区的PEDV流行毒株已经发生变异,形成了独特的流行进化分支。因此,本试验通过对变异毒株基因序列进行分析,以期为研制新的疫苗和预防控制该病提供实验数据和理论基础。

猪流行性腹泻病毒青海株M蛋白基因的克隆与功能位点分析

克隆了猪流行性腹泻病毒(PEDV)青海株(PEDV-QH)的M基因。经序列分析,PEDV-QH株编码膜蛋白M的开放阅读框(ORF)全长为681 bp,包含154A(22.61%),160G23.49%),217T(31.86%),150C(22.03%),编码226 aa,分子质量约为25 ku。PEDV-QH株的M基因与CV777、JMe2、Br1/87、JS-2004-2、KPEDV-9株核苷酸序列的同源性分别为98.5%、98.4%、98.4%9、8.2%和97.9%,推导的氨基酸序列同源性分别为99.1%、99.1%、98.7%、98.2%、97.8%;M基因推导的氨基酸序列分析显示,M蛋白3次跨膜,有1个潜在的原核膜脂蛋白脂结合位点,3个潜在的N-糖基化位点,4个潜在的丝氨酸或苏氨酸连接的蛋白激酶C或酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。与CV777及Br1/87核苷酸序列以及氨基酸遗传衍化关系分析显示,PEDV-QH株M基因的变异主要属于同义突变。

猪流行性腹泻疫苗毒株M基因的克隆与序列分析

从龙岩地区某猪场使用的弱毒疫苗中,提取毒株核酸.根据Gen Bank已发表的CV777毒株M基因序列设计合成特异性引物,利用RT-PCR技术扩增了疫苗毒株的M基因序列,并对其进行遗传进化分析.通过分析表明,疫苗毒株与韩国毒株virulent DR13的亲缘性较近,与2010年后中国流行毒株亲缘性较远.这一结果暗示该猪场使用的疫苗对于猪群的保护能力不足,无法有效对抗现在的流行毒株,需引起重视.

2016年河南省猪流行性腹泻病毒S、M基因遗传变异分析

为了解目前河南省猪流行性腹泻病毒(PEDV)S、M基因的遗传变异情况,本研究于2016年1月～2017年4月从河南省不同地区的16个规模化养猪场采集到67份病死仔猪小肠病料,应用RT-PCR进行PEDV检测,选取部分PEDV阳性样品分别进行PEDV S基因部分序列和M基因全序列的扩增、克隆和序列测定,并对其进行序列和遗传进化分析。结果显示,16个规模化养猪场67份样品中共有13个猪场的43份病料显示PEDV阳性,阳性率为64.2%,选取的13株PEDV代表株间S基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性分别为97.0%～99.9%和95.9%～100.0%,与经典株CV777同源性分别为94.9%～96.0%和93.6%～95.3%,与Gen Bank中登录的PEDV参考株同源性分别为92.0%～99.6%和89.8%～99.7%。13株PEDV间M基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性为98.2%～99.9%和96.0%～99.6%,与经典株CV777同源性分别为97.2%～98.2%和96.0%～98.2%,与PEDV参考株同源性分别为93.5%～99.6%和91.2%～99.1%。遗传进化分析显示,13株PEDV与中国疫苗株CV777处在不同的分群,与2016年中国福建省PEDV流行株XM1-2处于同一分支,表明河南省PEDV流行株与中国疫苗株亲缘关系较远。本研究结果明确了目前河南省PEDV的遗传变异情况,为河南省PED的诊断和防控提供了参考依据。

猪流行性腹泻病毒TaqMan检测方法的建立及基于S基因的遗传变异分析

旨在建立一种能快速、高效且灵敏的检测出猪流行性腹泻病毒(PEDV)的通用型TaqMan qPCR检测方法,并进一步了解河北省PEDV的遗传变异情况。本研究参考PEDV变异株AJ1102的M基因的保守区域设计特异性引物及探针,对引物浓度、退火温度等条件进行优化,建立了一种应用于猪场筛查PEDV的qPCR方法,并对筛查出的阳性样品S基因扩增测序后进行遗传进化分析。结果显示:该方法的特异性强,与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)及传染型胃肠炎病毒(TGEV)等猪病常见病原均无交叉反应;建立的检测方法对pMD19T-PEDV标准品的最低检测下限为1.09×101拷贝·μL^(-1),比普通PCR灵敏约100倍,敏感性高;组内和组间的变异系数均小于1%,重复性良好。基于S全基因成功克隆出的9条序列分布于GⅡ的两个亚群,克隆的9条序列的核苷酸相似性为96.6%~99.1%;氨基酸的相似性为94.6%~98.7%。结果表明:本研究得到的PEDV流行株与近年来国内分离株的关系较为密切,而与中国目前使用的疫苗株以及欧洲株亲缘关系较远,这表明河北部分地区PEDV当前流行毒株比较复杂且有变异的趋势,提示持续检测PEDV流行毒株变异动态的必要性。本研究不仅为PEDV的临床诊断提供了技术支持,更为进一步掌握PEDV遗传进化规律提供了参考依据。

2018—2019年广东省猪流行性腹泻病毒S1、M和ORF3基因遗传进化分析

为了了解2018—2019年广东省猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)的遗传变异情况,试验采用RT-PCR方法对采集到的69份样品进行PEDV抗原检测,并对部分阳性样品的S1、M和ORF3基因进行测序,再利用分子生物学软件对测序结果与NCBI中的参考毒株进行遗传进化树的构建、同源性分析及氨基酸序列比对。结果表明:经RT-PCR检测有38份样品为PEDV阳性,阳性率为55%,阳性率较高。在PEDV S1基因遗传进化分析中,检测毒株均位于G2分支,与VN-VAP1113核苷酸序列同源性较高,为96.0%~97.6%;主要有3个氨基酸缺失、5个氨基酸插入及多个氨基酸突变。在PEDV M基因遗传进化分析中,GDxh毒株位于G1-2分支,与DR13核苷酸序列同源性较高,为98.3%;GDhz-1毒株位于G2-1分支,与VN-VAP1113核苷酸序列同源性较高,为98.3%;其他12株毒株位于G2-2分支,与OH851核苷酸序列同源性较高,为97.4%~99.1%;主要有5个氨基酸突变和1个氨基酸插入。在PEDV ORF3基因遗传进化分析中,GDxh毒株与DR13核苷酸序列同源性为91.6%,主要有4个氨基酸突变和一段氨基酸缺失;其他检测毒株均位于G2分支,其中7株毒株与OH851核苷酸序列同源性为90.2%~92.0%,主要有5个氨基酸突变;另外5株毒株与VN-VAP1113核苷酸序列同源性均为87.6%,主要有11个氨基酸突变。说明2018—2019年广东省PEDV流行毒株主要为G1型和G2型,流行情况复杂,其S1和ORF3基因对应的氨基酸序列容易发生突变、插入或缺失,给该地区猪流行性腹泻的防治工作带来较大挑战。

2020—2021年我国部分地区猪流行性腹泻病毒S1、M和ORF3基因遗传进化分析

为了解2020—2021年我国部分地区猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)毒株变异及遗传进化情况,试验从多个地区的51家猪场采集340份疑似感染PEDV的猪小肠组织、粪便和肛拭子,提取病毒核酸后采用RT-PCR方法扩增S1、M和ORF3基因并测序,与GenBank中PEDV参考毒株进行比对分析,利用生物信息学软件构建遗传进化树,分析核苷酸序列同源性及氨基酸序列。结果表明:共获得57份PEDV阳性样品,来源于14家猪场,猪场阳性率为27.5%,并对从阳性猪场获得的14株毒株进行命名。与经典毒株CV777相比,14株PEDV毒株的S1、M和ORF3基因均出现不同程度的氨基酸突变。在14株毒株的S1基因中,Heyuan2021-7毒株位于G1-2分支,其余13株位于G2分支,14株毒株与参考毒株GD-A核苷酸序列的相似性较高,为89.3%~99.9%,存在多处氨基酸的缺失和插入。在M基因中,14株毒株位于G2分支且与参考毒株FR-001核苷酸序列的相似性为98.1%~99.7%,只存在氨基酸突变。在ORF3基因中,FC2021-1、GDzq2020-12、GDmm^(2)021-1和GDjm-DG-2021-12毒株位于G1-2分支,其余10株位于G2分支,14株毒株与参考毒株VN-JFP1013核苷酸序列的相似性为95.4%~99.3%,同源性较高,只存在氨基酸突变。说明2020—2021年我国部分地区流行的PEDV毒株有G1型和G2型毒株,其S1基因较M和ORF3基因突变程度更大,PEDV的流行情况相对复杂。

重庆地区猪流行性腹泻病毒M基因的序列分析

【目的】本文研究了重庆地区猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)M基因序列的特征。【方法】2015年期间采集了来自重庆地区3家规模猪场的病料,采用RT-PCR的方法对PEDV的M基因进行了扩增,测序后进行了分析,并与中国其他省份、美国、韩国的PEDV毒株进行同源性比较,完成了进化树的构建。【结果】3份病料中M基因片段长为426 bp,编码142个氨基酸。测序表明,3份毒株M基因同源性为98.7%~99.8%。与经典毒株CV777相比,核酸序列同源性为97.1%~98.2%。【结论】说明PDEV病毒M基因相对保守,可以作为临床检测的靶标。