Studies on Electrical Activation of Porcine Oocytes Matured in vitro and Embryo Culture Systems

Conditions for electrical parthenogenetic activation of porcine oocytes matured in vitro and in vitro culture systems of porcine embryo were studied. The best results were achieved under the conditions of electrical field strength and the pulse duration at 130Vmm-1/80 us, with a blastocyst development rate of (20.12 ± 8.18) % (P > 0.05). No significant difference was found between treatments of multiple pulses and a single pulse (P > 0.05). Parthenogenetic embryos were cultured with different methods and air conditions for 7 days in vitro, blastocyst development rate of embryos with changed culture media [ (26.44 ± 8.35) % ] or changed media with 10% fetal bovine serum (FBS) [ (17.68 ± 5.39)% ] on the fifth day showing no significant difference from that of embryos without change of culture media [ (25.30 ± 7.55) % , P > 0.05 ], while cell numbers of blastocysts from embryos with changed culture media (15.78 + 5.46 and 14.55 ± 4.81) were significantly lower than number of blastocysts from embryos without change of culture media (18.01 ± 6.79, P<0.01). Blastocyst development rate and blastocyst cell number of embryos cultured in lower O2(5%CO2: 7%O2:88%N2) also showed no significant difference from those in high O2(5%CO2 in air) [(20.78 ± 8. 80)% and 17.0016.12 vs. (25.30 ± 7.55)% and 18.0116.79, P>0.05]. It is concluded that change of culture media with the same new one or changing over to media with 10% fetal bovine serum (FBS) on the fifth day and low O2 environment are not necessary for porcine embryos development.

猪体外成熟卵母细胞的电激活及其激活后的体外培养

主要研究了猪体外成熟卵母细胞电激活的条件以及孤雌激活胚胎的体外培养体系。用不同场强、脉冲时程和脉冲次数激活猪体外成熟的卵母细胞。结果表明 ,在本试验条件下电激活最佳场强和脉冲时程为 130V·mm-1/ 80 μs ,其囊胚发育率为 (2 0 .12± 8.18) % (P >0 .0 5 )。多次脉冲并不比单次脉冲的激活效果好 (P >0 .0 5 )。孤雌激活胚胎用不同培养方式和气体环境在体外培养 7d ,发现 7d不换液与第 5天换液和第 5天换含 10 %胎牛血清的培养液其囊胚发育率 [分别为 (2 5 .30± 7.5 5 ) %、(2 6 .4 4± 8.35 ) %和 (17.6 8± 5 .39) % ]无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,后两者换液培养方式其囊胚细胞数 (15 .78± 5 .4 6、14 .5 5± 4 .81)明显低于不换液的 (18.0 1± 6 .79,P <0 .0 1)。同时发现低氧 (5 %CO2 ∶7%O2 ∶88%N2 )气体环境培养的胚胎囊胚发育率和囊胚细胞数和高氧环境 (5 %CO2 的空气 )无明显差别 ,分别为 [(2 0 .78± 8.80 ) %、17.0 0± 6 .12和 (2 5 .30± 7.5 5 ) %、18.0 1± 6 .79,P >0 .0 5 ]。表明激活后第 5天换原液和换含胎牛血清的培养液不能提高囊胚细胞数。低氧 (5 %CO2 ∶7%O2 ∶88%N2 )气体环境培养猪胚胎的效果不比高氧环境 (5 %CO2 的空气 )好。

猪卵母细胞第一极体排出与否对其早期胚胎发育的影响

探讨猪卵母细胞第一极体排出与否对其体外受精和孤雌激活后早期发育的影响.从屠宰场收集猪卵巢卵母细胞,体外成熟培养42～46 h后分为3组:排出第一极体组、没有排出第一极体组和对照组(不挑选第一极体卵母细胞),进行体外受精或化学孤雌激活之后放入胚胎培养液进行体外培养,分别于第48 h和第168 h统计分裂率和囊胚率.①体外受精后,有极体组的卵裂率略高于无极体组和对照组的卵裂率(62.19%±6.99%vs 55.40%±6.80%和56.33%±8.17%),各组间没有显著差异(p>0.05);囊胚率分别为4.87%±3.77%,2.33%±1.34%和3·50%±2.96%,有极体组明显高于无极体组(p<0.05),对照组与其它两组没有显著差异(p>0.05).②化学激活后,有极体组的卵裂率高于无极体组和对照组(75.45%±1.35%vs 64.81%±2.07%和69.64%±2.51%,p<0.05);有极体组的囊胚率也高于无极体组和对照组(24.54%±4.34%vs 12.96%±3.99%和18.75%±1.87%,p<0.05).排出第一极体卵母细胞比没有排出第一极体卵母细胞的发育能力强,但没有排出第一极体卵母细胞经体外受精或人工激活后也可以发育到囊胚阶段.

小鼠卵母细胞体外成熟培养系统的建立与优化

目的探讨激素刺激时间、体外培养时间对小鼠卵母细胞核成熟及不同激活方案对卵母细胞孤雌激活、胚胎发育能力的影响。方法孕马血清促性腺激素(PMSG)超排处理,在体外培养的不同时间点检测卵母细胞核成熟率(每个处理至少重复3次,3只/重复,以下实验相同)。分别采用乙醇结合6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)法和SrCl2法激活卵母细胞,胚胎培养液选用CZB[胎牛血清(FBS)或牛血清清蛋白(BSA)]两种,确定最佳激活方案。对不同时间点成熟的卵母细胞进行激活,确定最佳激活卵龄。研究缩短PMSG刺激时间对卵母细胞发育的影响。结果将PMSG刺激时间从46h缩短至24h,卵母细胞获得最高核成熟率(97.6%vs 91.9%)的培养时间由14h延长至16h;缩短PMSG刺激时间,核成熟率不受影响,但能显著降低激活率(91.2%vs 37.1%)和囊胚率(20.9%vs0.0%)。两种方法体内成熟卵母细胞激活率均高于90%,但囊胚率差异显著(P<0.05)。卵母细胞体外培养至24～26h时,激活率(89.5%)和囊胚率(21.9%)均达到最高点。结论建立了一种小鼠卵母细胞体外成熟培养系统,即PMSG超排处理46h、卵母细胞培养24h,CZB(10mmol/L SrCl2)激活2.5h后采用CZB(0.5%BSA)进行胚胎培养。

微滴中胚胎数量对猪孤雌胚早期体外发育的影响

[目的]优化猪早期胚胎培养体系,为单精子显微受精及体细胞核移植等研究提供依据。[方法]以猪的早期孤雌胚胎为材料,分别将人工激活后的70、50、30、15和5枚卵母细胞放入100μlNCSU-23培养液的微滴中进行培养,探讨了胚胎培养数量对猪早期孤雌胚发育的影响。[结果]100μl的培养微滴中培养30、50和70胚胎组,其分裂率分别为64.0%、65.2%和67.1%,显著高于5胚胎组,而与15胚胎组的差异不显著 在囊胚率方面,70胚胎组的最高,为3.0%,与50胚胎组的（1.7%）无显著差异,与5、15和30胚胎组的差异显著 各组的囊胚细胞数之间没有显著差异。[结论]在该研究条件下,当微滴体积为100μl时,培养50~70枚猪孤雌胚胎的效果最好,即,胚胎数∶培养滴体积=（1∶1.43~2.00）。

不同激活方法对猪体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

通过系统探讨不同孤雌激活方法对猪卵母细胞体外激活后发育效果的影响,比较了乙醇（Ethanol,EH）、离子霉素（Ionomycin,Ion：5μmol/L）、氯化锶（Strontium chloride hexahydrate,Sr^2＋：10 mmol/L）、6-二甲氨基嘌呤（6-dimethylaminopurine,6-DMAP：2 mmol/L）和放线菌酮（cycloheximide,CHX：10 mg/L）对猪卵母细胞激活发育的效果。结果表明：（1）9%EH激活处理10 min效果好于15 min;（2）使用9%EH激活处理10 min,再结合CHX、6-DMAP、Sr^2＋、CHX＋Sr^2＋、Sr^2＋＋6-DMAP、CHX＋6-DMAP或CHX＋6-DMAP＋Sr^2＋组处理3～4 h,以EH＋6-DMAP组效果最好,分裂率及囊胚率分别达到82.86%和22.86%;（3）在使用化学激活（Ion＋6-DMAP组和9%乙醇10 min＋6-DMAP组）和电激活（50 V/mm,50μs,2t）的方法中,Ion法激活猪卵母细胞效果较好,囊胚率达到37.50%;（4）卵母细胞包被的卵丘细胞层数不同对卵母细胞成熟激活有显著的影响,卵丘细胞层数4～6层和多于6层的卵丘-卵母细胞复合体孤雌激活的分裂率和囊胚率分别为（68.99%,32.56%）和（75.36%,37.68%）,2组之间差异不显著（P〉0.05）;但其显著高于其他组（P〈0.05）,这2组细胞在猪孤雌激活发育研究中是最佳的实验研究材料。

序贯培养法对猪孤雌激活胚胎发育能力的影响

经体外成熟、孤雌激活和培养获得猪胚胎,研究了不同培养体系、共培养体细胞和序贯培养对猪孤雌激活胚胎发育的影响。试验表明:孤雌激活卵母细胞在SOF+10%FCS培养体系中分裂效果最好,添加胎牛血清的NCSU-23和颗粒细胞对胚胎发育有促进作用,培养6d后发育到桑囊胚的比率增加(P<0.05)。在序贯培养的前3d,SOF培养基(不含葡萄糖)和颗粒细胞对胚胎的发育有促进作用,分裂率(P<0.05)和突破4细胞阻滞的数目显著增加,在培养的后3d,添加胎牛血清的NCSU-23和输卵管上皮细胞能支持较多胚胎发育到桑囊胚,桑囊胚的发育率为(59.5±3.2)%(P<0.05)。结果表明,SOF培养基和颗粒细胞+添加胎牛血清的NCSU-23和输卵管上皮细胞的序贯培养系统能较好的促进胚胎的发育。

乙二胺四乙酸钠对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响

本研究探讨了乙二胺四乙酸钠（EDTA—Na）对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响。利用屠宰场猪卵巢卵母细胞，在不添加或添加不同浓度EDTA—Na的成熟培养液中体外成熟44～48h，挑选核成熟卵母细胞进行孤雌激活，然后移到不添加或添加不同浓度EDTA—Na的胚胎培养液中进行体外培养168h。结果说明：（1）成熟液中添加适当浓度（25～100μmol／L）EDTA—Na对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用，在EDTA—Na浓度为100μmol／L时，效果最佳；（2）胚胎培养液中添加适当浓度（25～100μmol／L）EDTA—Na，对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用，在EDTA—Na浓度为100μmol／L时，效果最佳；（3）成熟液和胚胎培养液中同时添加100μmol／LEDTA—Na对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用；（4）成熟液或／和胚胎培养液中添加不同浓度EDTA—Na，对体外成熟培养后的猪核成熟卵母细胞及孤雌激活后的4-细胞孤雌胚SDS—PAGE电泳的蛋白质表达图谱都无显著影响。

不同化学激活方法和电激活参数对猪体外成熟卵母细胞早期孤雌发育的影响

本研究探讨了不同化学激活方法和不同电激活参数对猪体外成熟卵母细胞早期孤雌发育的影响。利用屠宰场猪卵巢卵母细胞，在体外成熟培养44～48h后，将核成熟卯母细胞分别用：（1）不同化学激活方法[①10％乙醇＋10μg／mL放线菌酮；②2．5mmol／L氯化锶＋10μg／mL放线菌酮；③5μmol／L离子霉素＋2．5mmol／L 6-二甲氨基嘌呤（6-DMAP）；④200μmol／L硫柳汞＋8mmol／L二硫苏糖醇进行激活处理；⑤对照组——不用任何激活剂（试验1）]；（2）用不同电场强度和脉冲时程进行电激活（试验2），之后放入胚胎培养液中进行体外培养7d。研究结果显示：（1）4种不同化学激活方法处理卵子的1原核形成率、2原核形成率和原核形成率都显著比对照组的高（P〈0．05），其中离子霉素＋6-DMAP组的2原核形成率和总原核形成率最高，分别为（23．1±3．5）％和（65．2±3．5）％，显著比其他处理组的都高（P〈0．05）；（2）4种不同化学激活方法处理组的囊胚率都比对照组的高（P〈0．01），其中离子霉素＋6-DMAP组的卯裂率及囊胚率最高，分别为（46．6±18．5）9／5和（5．6±4．2）％；（3）本研究所用的4种不同化学激活方法对猪4-细胞孤雌胚SDS—PAGE电泳的蛋白质表达图谱没有显著影响；（4）电场强度为1．7kV／cm、脉冲时程为50和70μs时猪体外成熟卯母细胞激活效果最好，卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数分别为：（77．4±9．7）％，（12．4±3．7）％，17．6±5．9和（75．1±10．6）％，（12．3±2．6）％，19．1±8．1。以上结果说明：（1）本研究所用的4种化学激活方法均能有效激活猪体外成熟卵母细胞，其中离子霉素＋6-DMAP的激活效果最理想；（2）在本实验室条件下，采用1．7kV／cm的电场强度、50～70μs的脉冲时程均能有效的激活猪体外成熟卵母细胞；（3）本研究所用的4种不同化学激活方法对猪4-细胞孤雌胚SDS—PAGE电泳的蛋白质表达图谱没有显著影响。

CB·氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养中的作用

[目的]研究CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中的作用,为优化相关技术体系提供依据。[方法]卵母细胞经体外成熟培养,采用不同孤雌激活方法(Ele.+CB组、CB组、Ele.组、对照组),研究CB在激活中的作用。激活后采用PZM3培养液,并去除氨基酸成分,探索氨基酸对体外培养胚胎的作用。[结果]CB+Ele.组的卵裂率显著地高于其他3组(P<0.05),囊胚率为32.7%,囊胚细胞数为61.4,而其他3组均未出现囊胚。电激活(脉冲电压100 V/mm,脉冲时程100μs,脉冲次数1次)联合CB处理,可激活卵母细胞体外发育至囊胚,CB有助于提高卵裂率、囊胚率。添加氨基酸的培养液中的卵母细胞的卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数显著提高(P<0.05),表明氨基酸能提高猪孤雌激活胚胎培养效果。[结论]添加CB、氨基酸在猪卵母细胞孤雌激活及体外培养体系中能提高胚胎的培养效果。

有无透明带猪卵母细胞电激活参数的优化及体外培养方式的建立

[目的]摸索无透明带猪体外成熟卵母细胞(ZFOs)电激活的条件和无透明带孤雌激活胚胎(ZFEs)的体外培养方式,为手工克隆法生产广西巴马小型猪体细胞核移植奠定基础。[方法]用不同场强、脉冲时程和脉冲次数激活ZIOs、ZFOs,用不同培养方式(微滴法和微穴法)培养ZIEs和ZFEs,检查第7天的囊胚率及囊胚的总细胞数。[结果]有带猪体外成熟的卵母细胞电激活最佳场强和脉冲时程为125 V/(mm.80μs),微滴法培养的囊胚发育率为(30.54±11.06)%;无带猪体外成熟的卵母细胞电激活最佳场强和脉冲时程为85V/(mm.80μs),微穴法培养,其囊胚发育率为(12.77±6.98)%;单次脉冲的激活效果好于多次脉冲。[结论]对有无透明带胚胎的培养方式,微穴法培养无透明带胚胎,微滴法培养有带胚胎较合适,一次脉冲可以有效激活卵母细胞。

17-β-雌二醇对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚的影响

为了观察17-β-雌二醇对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚的影响,选用屠体卵巢上的卵母细胞为试验材料,将其分为4组,分别在培养基中添加0、25、50、75μmol/L 17-β-雌二醇,体外成熟培养时间为36~44 h,受精胚培养时间为9 d。结果表明,在培养基中分别添加17-β-雌二醇0、25、50、75μmol/L时猪卵母细胞体外成熟率分别为58.5%、67.1%、80.9%、64.5%,卵裂率分别为51.2%、56.5%、63.5%、59.2%,囊胚形成率分别为16.7%、24.2%、19.5%、24.0%。结果显示在培养基中添加50μmol/L 17-β-雌二醇可提高猪卵母细胞体外成熟率至80.9%,提高体外受精胚的卵裂率至63.5%,但囊胚形成率以添加量为25μmol/L的组最高,说明添加17-β-雌二醇可提高猪卵母细胞成熟率、卵裂率以及囊胚率。

体外成熟对牛卵母细胞孤雌激活后发育潜力的影响

本试验在卵母细胞体外成熟的研究基础上,研究了培养用水、卵泡液和成熟时间对卵母细胞体外成熟及孤雌激活后发育潜力的影响。结果表明:(1)将卵母细胞分别于蒸馏水和Milli-Q超纯水配制的成熟培养液中培养2224h,孤雌激活后,卵裂率无显著差异(P>0.05);但孤雌卵在超纯水配制的胚胎培养液中培养,囊胚发育率为22.3%,明显高于在蒸馏水配制的培养液中的囊胚发育率14.1%(P<0.05)。(2)在成熟培养液中添加10%、20%卵泡液,成熟卵母细胞孤雌激活后的囊胚发育率(32.3%,30.9%)明显高于添加5%和0%卵泡液组的囊胚发育率(21.8%,22.7%,P<0.05)。卵母细胞在添加20%卵泡液的培养液中成熟培养,孤雌激活后囊胚孵化率明显低于添加0、5%、10%卵泡液组的囊胚孵化率(P<0.05)。(3)成熟28h或30h的卵母细胞孤雌激活后,其囊胚发育率(30.5%或29.4%)明显高于成熟24h或26h组的囊胚发育率(20.5%或22.1%,P<0.05)。

乙二胺四乙酸钠对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响

探讨乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na）对猪卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后早期发育的影响。利用屠宰场猪卵巢卵母细胞，在不添加或添加不同浓度EDTA-Na的成熟培养液中体外成熟44～48h，挑选核成熟卵母细胞进行孤雌激活，然后移到不添加或添加不同浓度EDTA-Na的胚胎培养液中进行体外培养168h。结果表明：（1）胚胎培养液中添加适当浓度（25～100μmol·L^-1）EDTA-Na对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用，在EDTA-Na浓度为100μmol·L^-1时，效果最佳；（2）成熟液和胚胎培养液中同时添加100μmol·L^-1 EDTA-Na对体外成熟猪卵母细胞孤雌激活后的早期发育具有促进作用；（3）成熟液或／和胚胎培养液中添加不同浓度EDTA-Na对体外成熟培养后的猪核成熟卵母细胞及孤雌激活后的4一细胞孤雌胚SDS-PAGE电泳的蛋白质表达图谱都无显著影响。