牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激巨噬细胞表达髓样细胞触发受体-1的研究

目的探索牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Pg-LPS)刺激的巨噬细胞中髓样细胞触发受体-1(TREM-1)、可溶性TREM-1(sTREM-1)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达,探讨TREM-1与牙周炎发病机制的可能关联。方法使用豆蔻酰佛波醇乙酯诱导人单核细胞系细胞THP-1分化为巨噬细胞,分别予以0(空白对照)、0.5、1.0μg·mL^(-1)的Pg-LPS刺激,并根据不同时间分组:孵育4、6、12、24 h组。实时定量聚合酶链反应检测巨噬细胞中TREM-1 mRNA的表达,Western blot分析TREM-1蛋白表达的差异,细胞免疫荧光染色检测TREM-1在巨噬细胞中的表达部位,并通过酶联免疫吸附试验对细胞培养液中的sTREM-1及TNF-α进行检测。结果与空白对照组相比,Pg-LPS刺激巨噬细胞后TREM-1 mRNA、TREM-1蛋白及细胞培养上清液中的s TREM-1表达均显著增强(P<0.05);1.0μg·mL^(-1) Pg-LPS组TREM-1 mRNA、TREM-1蛋白及细胞培养上清液中的sTREM-1表达量高于0.5μg·mL^(-1)组,且分别从6、4、4 h时间点开始差异具有统计学意义(P<0.05);细胞免疫荧光染色结果显示,Pg-LPS(1.0μg·mL^(-1))刺激巨噬细胞24 h后,可见TREM-1蛋白呈阳性染色,且TREM-1的染色部位主要位于巨噬细胞的细胞膜区域;Pg-LPS刺激巨噬细胞后TNF-α的分泌水平升高(P<0.05),其中1.0μg·mL^(-1) Pg-LPS组表达量高于0.5μg·mL^(-1)组,且从12 h开始差异具有统计学意义(P<0.05);0.5μg·mL^(-1) Pg-LPS刺激巨噬细胞后TREM-1 mRNA、TREM-1蛋白、sTREM-1间表达呈正相关(r=1,P<0.05),但与TNF-α表达不存在相关性;在1.0μg·mL^(-1) Pg-LPS刺激巨噬细胞后检测到了具有统计学意义的sTREM-1与TNF-α表达的正相关性(r=1,P<0.05)。结论巨噬细胞受到Pg-LPS刺激后可出现Pg-LPS浓度依赖性的TREM-1 mRNA、TREM-1蛋白及细胞培养上清液中的sTREM-1表达上调,且能观测到三者之间表达的正相关性;同时细胞培养上清液中的TNF-α也出现Pg-LPS浓度依赖性的表达上调,在高浓度Pg-LPS(1.0μg·mL^(-1))刺激下与sTREM-1表达量呈正相关。该结果提示,TREM-1作为促炎受体蛋白,可能通过调节巨噬细胞TNF-α的表达来实现牙周炎发展的促进作用。

牙龈卟啉单胞菌脂多糖对髓系细胞触发受体的激活作用

目的:研究牙龈卟啉单胞菌(Pg)脂多糖(LPS)对巨噬细胞中髓系细胞触发受体-1(TREM-1)和-2的激活作用。方法:分离培养小鼠腹腔巨噬细胞,并以1mg/L的Pg-LPS刺激。采用实时荧光定量PCR技术检测TLR-2、TLR-4、TREM-1和TREM-2转录水平的变化,流式细胞术检测蛋白水平的变化,酶联免疫反应检测培养液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和巨噬细胞炎症蛋白-lα(MIP-lα)水平的变化。结果:Pg-LPS刺激巨噬细胞2h后,巨噬细胞内TLR-2和TREM-1的转录水平均表达上调;流式细胞检测显示24h后,细胞内TREM-1和TLR-2水平显著上调;TLR-4和TREM-2在实验中未见显著变化;Pg-LPS刺激巨噬细胞24h后,TNF-α和MIP-1α水平显著上升组;TREM-1的抑制物LP-17多肽显著抑制了Pg-LPS的炎症刺激作用。结论:TLR-2和TREM-1参与了巨噬细胞应答Pg-LPS的先天免疫过程。

髓系细胞触发受体1在巨噬细胞应答牙龈卟啉单胞菌免疫反应中的表达

目的 研究髓系触发细胞受体1（triggering receptors expressed on myeloid-1,TREM-1）是否参与巨噬细胞对牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）的先天免疫反应,以进一步分析TREM-1在牙周病发病中的作用.方法 分离培养小鼠腹腔巨噬细胞,空白对照组以含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液培养,实验组加入Pg刺激;实时荧光定量PCR分析TREM-1基因转录水平的变化,流式细胞术检测其蛋白水平的变化;采用LP-17多肽（10、100和1000 μg/L）特异性阻断TREM-1的作用,酶联免疫吸附测定法检测培养液中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-αα）和白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）水平的变化.结果 细菌刺激巨噬细胞2h后,TREM-1基因转录水平上调（7.99±1.11）倍;细菌刺激24 h后,流式细胞检测显示TREM-1蛋白表达水平上调：平均荧光强度空白对照组为（7.05±1.85）,实验组为（13.17±2.33）;100和1000 μg/L的LP-17多肽阻断TREM-1后,TNF-α和IL-6的分泌下降.结论 TREM-1促进了巨噬细胞对Pg的先天免疫反应,参与了牙周病的发病过程.

牙龈卟啉单胞菌脂多糖通过髓样细胞触发受体-1调控巨噬细胞极化状态的研究

目的探究牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激巨噬细胞后,髓样细胞触发受体-1(triggering receptors expressed on myeloid cells-1,TREM-1)表达与M1、M2型极化的关系,进一步探讨巨噬细胞TREM-1在牙周炎发生发展中的作用机制。方法使用豆蔻酰佛波醇乙酯诱导人单核细胞系THP-1分化为巨噬细胞,予以0(空白对照组)和1μg/ml的Pg-LPS(LPS组)刺激,同期加入终质量浓度为0.1μg/ml的TREM-1抑制剂LP17(LPS+LP17组)或对照肽(LPS+对照肽组),培养24 h后用实时荧光定量PCR(real-time quantitative-PCR,RT-qPCR)检测TREM-1和巨噬细胞M1、M2型极化标志物(分别为CD86、CD206)及其极化相关细胞因子[分别为肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-10]mRNA表达变化,蛋白质印迹法检测TREM-1、CD86、CD206蛋白含量,酶联免疫吸附测定法检测巨噬细胞培养上清液中TNF-α、IL-1β及IL-10的表达。结果细胞培养24 h后,LPS组巨噬细胞中TREM-1相对mRNA表达量(1.40±0.14)及蛋白表达量(3.85±0.24)均较空白对照组(分别为1.01±0.18、1.00±0.05)显著升高(P<0.05),同时M1型极化标志物CD86 mRNA及蛋白表达(分别为1.42±0.01、1.55±0.07)均较空白对照组(分别为1.00±0.09、1.00±0.10)显著上调(P<0.01),且M1型极化相关细胞因子TNF-α、IL-1βmRNA及蛋白表达量均显著增加(P<0.05);加入TREM-1阻断剂LP17后,与LPS组相比,TREM-1 mRNA及蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05),CD86 mRNA(0.96±0.00)和蛋白(1.36±0.02)表达水平均显著下降(P<0.05),TNF-α、IL-1βmRNA及蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。对于M2型极化标志物CD206及极化相关细胞因子IL-10,细胞培养24 h后,CD206 mRNA(0.56±0.05)及蛋白表达(0.25±0.04)均较空白对照组(分别为1.02±0.25、1.00±0.10)显著下调(P<0.01),IL-10 mRNA较空白对照组表达显著上调(P<0.05),其蛋白表达水平与空白对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);LPS+LP17组CD206、IL-10 mRNA表达均较LPS组显著下调(P<0.05),CD206、IL-10蛋白表达在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论TREM-1及其下游信号通路可能参与了Pg-LPS介导的巨噬细胞M1型极化,从而在牙周炎发生发展中发挥促炎作用;尚无证据表明TREM-1是否参与调控Pg-LPS介导的巨噬细胞M2型极化。