四川烟区CMV和PVY株系分化研究

为了明确当前四川烟区蚜传病毒的株系分化情况,该研究利用RT-PCR技术对四川烟区的CMV和PVY两种蚜传病毒病进行了检测和鉴定.依据病毒的CP基因序列合成引物,以烟草病叶的总RNA为模版,RT-PCR扩增得到了657bp的CMVCP片段和759bp的PVYCP片段,获得的基因片段连接到pGEM-T Easy载体上,测序.样品检测结果显示,在252份样品中CMV和PVY的检出率分别为33.33%和34.52%,两者复合侵染率为15.87%.构建的系统发育树分析结果表明,四川烟区的CMV株系分化不明显,主要属于IB亚组.PVY有着明显的株系分化现象,PVY^(N:O)株系、PVY^O株系、PVY^N株系在四川烟区均有发生.研究结果可能对培育抗病品种,控制这两种蚜传病毒具有一定的参考价值.

PVY^N与PVY^O病毒RT-PCR快速检测体系研究

马铃薯Y病毒(PVY)是侵染马铃薯的重要病毒之一,严重影响马铃薯的生产。本文通过对PVY病毒N株系(PVYN)与O株系(PVYO)的基因序列进行比较,在其外壳蛋白同源区设计一对通用引物,建立了PVY病毒的RT-PCR检测体系。另外在N株系与O株系同源区设计一条3′引物,选择N株系与O株系差异区设计两条5′端引物,建立了可鉴定PVYN与PVYO的复合RT-PCR体系。这个体系的建立,对于马铃薯脱毒苗的检测与PVY病毒的调查及病理研究都具有一定的应用价值。

铜元素诱导烟草抗PVY^N相关生理生化及信号物质的研究

通过气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)及生理生化指标的测定,研究了铜(Cu)元素诱导感染PVYN的烟株信号物质的积累及对系统抗性的影响。结果表明:喷施Cu元素能延迟烟株显症和叶脉出现褐色坏死时间,降低发病程度,病毒增殖受到抑制,烟株体内的与抗性相关物质如脯氨酸及可溶性糖含量升高,电解质的外渗减少。此外,Cu元素处理能诱导信号物质水杨酸和乙烯的积累,水杨酸含量在接种后15d达到最大量3.93μg·g-1,为接种对照的1.3倍;而乙烯释放量在3～9d内均高于接种对照,在12d时乙烯释放量显著低于接种对照,分析认为前期Cu元素处理后诱导了乙烯释放的增强,进行抗性信号的传递。因此,喷施Cu元素后可以诱导烟草植株产生抗病性,增强烟草对PVYN侵染的抵抗力,并且诱导了相关抗性信号的传递。

TMV、PVY福建分离物分子鉴定及末端区域变异分析

为及时准确地鉴定出病毒病原和追踪了解病毒病流行变异趋势,使用特异性引物对福建烟区病毒烟叶样品进行RT-PCR分析,分别鉴定出病毒病原为TMV和PVY。序列测定结果表明PCR扩增产物为预期的TMV 5’末端和PVY 3’末端序列,大小分别为959和646个核苷酸,均包含末端非编码区和部分病毒功能基因蛋白编码区。将所获得的病毒末端序列与国内外报道的主要病毒分离物的同一区域进行比较,分析结果显示TMV 5’端非编码区保守性极强,不同分离物之间部分126 kDa或183 kDa编码蛋白N端编码区表现出一定程度的变异(突变),PVY外壳蛋白编码区与3’末端非编码区变异数量差异不大,变异(突变)均主要为碱基转换,环境自然选择压力对病毒基因组变异(突变)具有一定的影响。

利用qRT-PCR技术对PVY重组株系的鉴定

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)作为制约马铃薯生产的重要病毒之一,株系分化繁杂。近年被科学家研究分离的PVY^(N-Wi)和PVY^(NTN-NW)株系而言,其基因组结构极为相似但致病性差异较大。【方法】本研究利用qRT-PCR方法,方便快捷的检测出马铃薯Y病毒的这2种不同株系,同时并使之可成功且稳定的应用于马铃薯生产中。通过查找Gen Bank已公布的PVY^(N-Wi)和PVY^(NTN-NW)株系的全基因组序列,设计用于qRT-PCR检测,扩增目的片段大小为150 bp左右的特异性引物,应用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)进行检测。【结果】通过设计的引物对保存的试管苗毒源进行检测,可以成功的精准鉴别出PVY^(N-Wi)和PVY^(NTN-NW)株系;同时对100份田间采集的叶片样品进行检测,成功的检测出100份样品中32份样品,受到PVY^(N-Wi)株系侵染;27份样品,受到PVY^(NTN-NW)株系侵染;同时存在9份样品,可能同时受到PVY^(N-Wi)、PVY^(NTN-NW)株系的侵染。【结论】实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)可适用于马铃薯叶片样品的检测,为株系的快速鉴定提供了可靠的方法,可用于生产中大规模样品的检测,有利于及时采取防控措施,降低损失。

利用人工ta-siRNA策略培育抗PVY烟草

人工ta-siRNA基因沉默技术具有同时表达多个ta-siRNA和产生ta-siRNA位置固定等特点,在精确性和高效性等方面有明显优势。本研究以马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)外壳蛋白(coat protein,CP)为靶基因,选取不同位置的3个siRNA为靶序列,烟草TAS3a作为ta-siRNA表达的骨架,分别构建植物表达载体PVY-CP5'、PVY-CPM和PVY-CP3',并利用叶盘法转化烟草NC89。瞬时表达检测结果显示,3个syn-tasiRNA植物表达载体均能在植物体内成功表达siRNA;抗病性鉴定发现,转PVY-CP5'、PVY-CPM和PVY-CP3'的转基因株系中抗病株系的比率分别为45. 08%、27. 21%、61. 90%;Northern杂交分析显示,目的片段转录产物(总RNA)的积累量与植株的抗病性呈负相关,转基因植株中均有siRNA存在,表明植株的病毒抗性是由RNA介导的。

马铃薯Y病毒脉坏株系(PVY^N)的侵染对烟草光合作用和呼吸作用的影响

感染马铃薯Y病毒脉坏死株系后，烟草叶片的叶绿素含量和Hill反应活性均明显降低，光合速率在接种后2天出现增高现象，随后逐渐降低，呼吸速在接种的后2～6天明显降低，显症初期呼吸速率增高，随后大幅度降低．

PVY和PVS病毒复合侵染对马铃薯光合及营养品质的影响

以2个马铃薯高代品系为实验材料,研究马铃薯病毒Y(PVY)和S(PVS)复合侵染对马铃薯叶片SPAD值、最大净光合速率、表观量子效率、气孔导度、暗呼吸速率、蒸腾速率、光补偿点、胞间CO_2浓度和饱和光强等光合参数,以及马铃薯块茎产量、干物含量、淀粉含量、还原糖含量、粗蛋白含量等产量品质指标的影响。结果表明:(1)田间受到PVY和PVS病毒复合侵染后,马铃薯品系2010-11植株的叶片PVS病毒含量显著低于品系34-2植株,2010-11植株的叶片PVY病毒含量同样低于品系34-2植株,但差异不显著。(2)与对照相比,感病后马铃薯品系34-2和2010-11的平均单株产量分别显著降低48.54%和19.98%,淀粉含量分别降低8.06%和3.38%,但不显著;粗蛋白含量分别显著升高14.05%和29.17%;还原糖含量分别显著降低11.11%和14.29%;34-2干物量含量显著降低6.9%,2010-11干物质含量略降低0.66%。(3)两品系感病植株的光合参数SPAD值分别显著降低13.37%、20.10%;最大净光合速率分别显著降低32.48%和4.54%;其它光合参数变化没有规律性。研究发现,PVY和PVS病毒混合侵染使马铃薯植株叶片叶绿素含量显著降低,进而影响光合作用的正常进行;病毒侵染使块茎中还原糖和淀粉的积累显著受到抑制,但能够促进块茎中粗蛋白的含量显著提高。

不同抗性烟草品种(系)苗期接种PVY后生理生化指标变化

以SY04-3、云烟87、延晒6号及NC95等4个具有代表性的烟草品种为试材,研究接种PVY后烟苗干物质积累、叶绿素含量、光合速率、抗氧化酶活性等生理指标的变化。结果表明:抗病性越强的品种相比对照处理在干物质积累、净光合速率及叶绿素含量的下降幅度越小,而丙二醛含量的上升幅度越小;抗病性越强的品种在前期抗氧化酶活性上升幅度越大而后期下降幅度越小。以接种PVY 28 d的各生理生化指标值进行抗性综合评价,抗性由强到弱依次为SY04-3、延晒6号、云烟87和NC95,其综合排序与人工接种鉴定结果保持一致,因此,可将干物质积累、光合速率、抗氧化酶活性等逆境生理指标作为辅助鉴定烟草抗PVY强弱的依据。

烟草抗PVY育种材料的筛选与应用

马铃薯 Y病毒对东北烟区烟草生产危害日趋严重。通过病圃发病情况调查和温室接种鉴定 ,初步筛选出 CV91、8741 4、80 2 1三份常规抗马铃薯 Y病毒材料 ,其中 CV91在田间调查和温室接种鉴定中均表现为高抗马铃薯 Y病毒 ;转基因抗马铃薯 Y病毒材料 85- 2、86- 1、87- 2、89- 1、94- 1、95- 1、98- 1温室接种鉴定结果为对 PVY免疫。利用 CV91育成了中抗 PVY的新品系 91 1 1 -2

基于烟草蚜传病毒病的黄瓜花叶病(CMV)和马铃薯Y病毒病(PVY) LAMP检测体系研究

本文对基于烟草蚜传病毒病的黄瓜花叶病(CMV)和马铃薯Y病毒病(PVY),在优化LAMP体系、LAMP反应的最佳体系、LAMP产物的检测、LAMP灵敏性检测、田间样品的检测等几个方面进行了研究。结果表明:LAMP体系Mg2+的最佳浓度为6 mM,dNTPs的最佳浓度为1.2 mM;LAMP的最佳反应条件为反应温度63℃、反应时间为40 min;CMV和PVY的阳性LAMP产物显示为绿色,阴性LAMP产物显示为橘黄色;检测方法的灵敏度在DNA水平上可达到10~3 ng/μL;田间采集样品随机检测表明,建立的LAMP检测体系准确可靠。

青岛及周边地区马铃薯Y病毒株系类型分析

马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是目前马铃薯生产中的重要病毒,PVY侵染马铃薯会造成产量、质量的严重下降。为了探明青岛及周边地区PVY株系类型,本次共采集青岛及周边地区485份马铃薯疑似PVY样本,共检测出298份PVY阳性样本。对PVY样本进行RT-PCR扩增,结果显示:本地区的主要株系为PVY^(NTN-NW)(SYR-Ⅱ型),占比为62.4%;PVY^(N-Wi)株系占比为31.6%;复合侵染株系占比为6.0%。对复合侵染株系的单株块茎(编号ShouGuang)进行测序、BLSAT比对及Simplot和RDP软件分析,显示PVY复合侵染的马铃薯植株体内存在两种重组类型(ShouGuang-Y1和ShouGuang-Y2);发生重组的位点主要集中在P1-1、HC-Pro/P3、6K2/VPg 3个区域。通过对PVY的不同变异株系分析,可为PVY株系的遗传多样性提供理论基础,为青岛及周边地区PVY防控提供理论依据。

马铃薯Y病毒CP基因RNAi载体构建与干涉效果测定

RNA沉默(RNAi)介导的植物抗病毒研究是近年来引起广泛关注的一项植物抗病毒基因工程策略。马铃薯Y病毒(PVY)在世界范围内引起马铃薯、烟草等重要经济作物的病害,并且造成严重的经济损失。本文以PVY的外壳蛋白(CP)基因为模板扩增300bp和354bp两个片段,正向和反向分别插入植物表达载体pROKⅡ的35S启动子下游,从而构建了以PVY的CP基因为靶标的RNAi植物表达载体pROKY300,转入农杆菌EHA105中,以农杆菌渗入法在本氏烟中瞬时表达与PVYCP同源的hairpin RNA。结果表明,瞬时表达的hairpinRNA有效干涉了PVY侵染。

马铃薯Y病毒CP基因5′端和3′端反向重复结构介导的抗病性研究

本研究克隆了来源于马铃薯Y病毒坏死株系(PVYN)外壳蛋白(CP)基因(PVYNCP)5′端和3′端的反向重复cDNA序列,并构建了植物表达载体pROKII-5′IR和pROKII-3′IR,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草NC89,分别获得166和126株转基因烟草。抗病性试验表明,转化PVYNCP基因3′端茎50 bp(环50 bp)hp RNA(hairpin RNA)的烟草抗病率达69%,而转化PVYNCP基因5′端相同片段长度的hpRNA的烟草却全部发病。Southern blot结果表明,转基因植株的抗病性与转基因的拷贝数之间无明显的相关性;Northern blot结果表明,目的片段转录产物的积累量与植株的抗病性呈负相关,证明所获得的抗病性是RNA介导的抗病性。研究结果证明PVYNCP基因的3′端比5′端更能有效地诱发基因沉默,并且hpRNA茎部的长度可减少到50 bp。该结果为探索利用CP基因的最短长度和有效部位的基因片段来培育多抗病毒转基因植物提供了依据。

采用多基因联合方法鉴定福建长乐和福清产区马铃薯Y病毒株系组成

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯生产上危害较为严重的病毒,也是制约马铃薯可持续发展的主要病毒之一。论文旨在开发一套简便、准确、快速的PVY分子鉴定技术,并采用该技术及时查明福建省部分产区PVY病害的发生、分布及PVY株系组成。【方法】采用ELISA方法对采自福建省长乐市、福清市马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行检测,并根据文献报道的PVY P1、VPg和CP基因保守区设计3对简并引物,对ELISA检测后的阳性样品进行基因扩增、克隆,并将获得的序列进行核苷酸序列一致性、重组位点、基因型分布和系统发育分析。【结果】ELISA检测结果表明,17份样品中有13个样品与PVY抗体呈阳性反应,其他呈阴性反应。13个阳性样品均能成功扩增出3个与P1、VPg和CP基因预期大小一致的特异片段。BLAST比对分析显示P1、VPg和CP基因与文献报道的已知PVY分离物的核苷酸序列一致性分别为72%—99%、85%—99%和88%—99%。P1、VPg和CP 3个基因联合序列分析显示,FQ01分离物与PVY^(N-Wi)株系的核苷酸序列一致性最高,FQ08分离物与PVYE株系的核苷酸序列一致性最高,CL01、CL02、CL05和CL13 4个分离物与PVY^(NTN-NW)株系SYR-I型的核苷酸序列一致性最高,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12 7个分离物与PVY^(NTN-NW)株系SYR-II型的核苷酸序列一致性最高。重组分析显示,除CP基因外,长乐市和福清市两个产区的PVY分离物的P1和VPg基因中均检测到显著的重组信号。基因型统计分析结果显示,长乐产区的P1基因为N型(60%)和N×O重组型(40%),VPg基因均为N×O重组型,而CP基因均为O型,而福清产区的P1基因为N型(25%)和N×O重组型(75%),VPg基因为N×O重组型(87.5%)和O型(12.5%),而CP基因除了一个分离物为N型外,其他均为O型。系统发育分析显示分离物FQ01与PVYN-Wi株系聚为一簇,FQ08与PVYE株系聚为一簇,CL01、CL02、CL05和CL13与PVY^(NTN-NW)株系SYR-I型聚为一簇,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12与PVY^(NTN-NW)株系SYR-II型聚为一簇,表明在系统发育关系上,分离物FQ01与PVYN-Wi株系最近,FQ08与PVYE株系最近,CL01、CL02、CL05和CL13与PVY^(NTN-NW)株系SYR-I型最近,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12与PVY^(NTN-NW)株系SYR-II型最近。【结论】PVY在福建省长乐市、福清市马铃薯种植区普遍存在,重组株系已成为田间的主流株系,且PVY^(NTN-NW)已成为优势重组株系。

马铃薯Y病毒的RT-PCR检测

通过两种方法提取了烟草病叶中PVY病毒的RNA，然后针对PVY^N的CP基因序列，设计合成了一对特异性引物，运用反转录PCR技术对提取的PVY－RNA进行了体外扩增，结果得到与预期大小相一致的780bp片段，而对照未得到任何产物，从而建立了运用RT－PCR手段检测植物中PVY的又一有效途径，并运用此方法对东北三省部分地区马铃薯种薯中PVY的带毒情况进行了检测。

核基质结合区对马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因介导抗病性的影响

为探索核基质结合区(m atrix attachm ent reg ions,MAR s)对RNA介导的病毒抗性的影响,我们将从烟草中克隆到的核基质结合区TM 2构建在包含马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因的植物表达载体pRPVYCPN的表达盒的两侧,构建了植物表达载体pRTM 2CPNTM 2。采用农杆菌介导基因转化法,将表达载体pRPVYCPN和pRTM 2CPNTM 2转入烟草品种NC89中,分别获得了144株和344株转基因烟草。抗病性检测发现,核基质结合区的存在能明显提高RNA介导抗性的产生效率。在含MAR s转基因植株中,抗病植株的比率为15.1%,而不含核基质结合区的转基因植株的抗病比率则为8.3%。这一研究结果对抗病毒植物的分子育种和转基因表达调控有指导意义。

分子标记辅助选育聚合烟草花叶病毒属病毒抗性基因(L^4)及马铃薯Y病毒抗性基因(Pvr4)的甜椒自交系

烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒是危害我国辣椒生产最重要的病毒之一,其中辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)近些年来危害日趋严重。L系列等位基因(L^1、L^2、L^3、L^4)是抗烟草花叶病毒属的主要抗性基因。为了提高辣椒品种烟草花叶病毒属病毒和马铃薯Y病毒(PVY)抗性,本试验分别以CM334(抗PVY,含Pvr4基因)和引进材料200375(抗PMMoV,含L~4基因)为抗源,以甜椒自交系83-163(中抗疫病和CMV)为回交亲本,进行多代回交并自交,利用分子标记辅助选择结合苗期抗病性鉴定、形态选择,最终选育获得了聚合烟草花叶病毒属病毒抗性基因L^4和马铃薯Y病毒抗性基因Pvr4的早熟、大果型甜椒自交系PT83-163(中抗疫病和CMV,携带抗病基因Pvr4和L^4),经人工接种鉴定表现抗病,其他园艺性状与自交系83-163相当。

马铃薯Y病毒与介体蚜虫传毒的关系研究进展

对蚜虫的传毒特性、影响传毒效率的因素、传毒机制、蚜虫传播与马铃薯Y病毒病发生流行的关系、蚜虫带毒的检测方法、治蚜与防病的关系等方面的研究进展进行了综述。

马铃薯Y病毒株系分化研究进展

马铃薯Y病毒(PVY)是我国马铃薯上最重要的病毒之一,分布广泛,危害严重。PVY株系分化现象明显,已被广泛认同的PVY株系种类包括3种:PVYO株系、PVYN株系和PVYC株系。近年来,有很多研究表明,PVY可通过基因突变或基因重组等方式分化出多种不同类型的株系,引致更为严重的症状。鉴此,从PVY各株系的特征、产生的分子机制、检测与鉴定方法、我国PVY株系分化情况等方面对目前PVY株系分化方面已取得的研究进展进行了综述。