桃果实铜锌超氧化物歧化酶基因PpCuZnSOD的克隆与分析

从已构建的硬肉桃(Prunus persica L.)双久红果实SSH文库中获得4条铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)基因的ESTs,通过blast比对和电子克隆后进行了序列拼接和经RT-PCR方法,获得桃果实铜锌超氧化物歧化酶基因PpCuZnSOD全长cDNA序列(GenBank登录号:JX217743)。该基因全长665bp,包含一个459bp的ORF(120bp-578bp),编码152个氨基酸,推测蛋白分子量为15.38kDa,理论等电点为5.60。该基因具有典型的高度保守的Cu2+和Zn2+活化中心及特征信号,其氨基酸序列与其他植物的CuZnSOD具有很高的相似性。生物信息学分析结果表明,该蛋白定位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白。二级结构分析结果表明,该蛋白主要由无规则卷曲和延伸链等蛋白质二级结构元件构成,三维结构预测结果显示,PpCuZnSOD有3个转角环和8个折叠构成桶状的活性中心。系统进化分析结果表明PpCuZnSOD与小金海棠(Malus xiaojinensis)sod2同源关系最近,而与荔枝(Lichichinensis)、龙眼(Dimocarpus longan)和拟南芥(Arabidopsis trifoliate)等亲缘关系较远。QPCR结果表明,PpCuZnSOD在幼果中表达量最高,雌蕊和雄蕊次之,花瓣和叶片中表达量最少;果实成熟前后,PpCuZnSOD在硬肉芽变桃双久红果实中的表达量显著高于软肉桃川中岛白桃中的表达量,表明该基因可能在维持果实质地和硬度方面有一定作用。本研究结果为进一步研究该基因在桃果实成熟软化中的作用奠定了基础。

桃果实PpCuZnSOD基因的原核表达、纯化与鉴定

【目的】为了实现桃铜锌超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的高效表达,获得表达稳定、蛋白纯度高、活性强的工程菌,【方法】将前期获得的PpCuZnSOD基因(GenBank登录号:JX217743)重组到原核表达载体pET-32a(+)中,并转化到Escherichia coli BL21(DE3)宿主菌,经IPTG进行诱导表达。对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting检测,镍柱亲和层析纯化,并采用Brad Ford方法测定融合蛋白浓度,黄嘌呤氧化法分析其酶活。【结果】成功的构建了原核表达载体pET-32a(+)-PpCuZnSOD,并获得分子质量约为35 kDa的诱导表达产物,纯化后融合蛋白浓度为183.7 mg·L-1,活性为5.23×103U·mg-1。【结论】成功构建了桃pET-32a(+)-PpCuZnSOD原核表达载体,表达量高、稳定性强,重组表达产物具有较高CuZnSOD酶活性,为桃CuZnSOD酶的进一步研究奠定了基础。

转桃PpCuZnSOD基因大豆的耐旱性

为探索桃(Prunus persica L.)铜/锌超氧化物歧化酶基因(PpCuZnSOD)在植物抗干旱胁迫中的作用,应用农杆菌介导法,将PpCuZnSOD基因转入大豆品种中黄13中。Southern印迹分析证实PpCuZnSOD基因已整合到大豆基因组中。定量PCR分析结果表明,转基因大豆中PpCuZnSOD表达水平均明显增加。用15%PEG4000模拟干旱胁迫时,转基因大豆种子萌发率与主根长显著高于非转基因大豆。在干旱10 d条件下,转基因大豆与非转基因大豆相比,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性增加,而丙二醛(MDA)含量下降,叶绿素含量降低较少。活性氧(ROS)染色结果显示,转基因植株在干旱胁迫下活性氧少于非转基因植株。复水后4 d,转基因大豆的成活率显著高于非转基因大豆。这些结果表明,PpCuZnSOD能提高大豆的耐旱性。

过表达桃PpCuZnSOD基因提高大豆耐盐性研究

为研究桃(Prunus persica L.)自由基清除剂CuZnSOD编码基因对于大豆耐盐性的促进作用,将桃PpCuZnSOD全长基因克隆到连有35S启动子的表达载体上,并通过农杆菌导入大豆基因组中,通过PCR和Southern杂交方法检测阳性转基因植株,并对T2代转基因植株进行基因表达量分析和耐盐性评估。结果表明:转基因植株有较高的耐盐性,表现为种子萌发率和存活率高,叶绿素含量高。转基因植株在盐胁迫下存活时间更长,与非转基因植株相比,转基因植株的SOD、POD、CAT酶活性较高,而丙二醛含量显著降低。研究结果表明PpCuZnSOD基因过表达可以显著提高大豆植株的SOD活性水平,缓解盐胁迫对大豆的氧化损伤。