一种基于连续PMCA的PrP^Sc体外扩增方法的建立

为建立一种基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)的体外稳定扩增方法以观察PrPSc是否能在体外连续传代,我们分别制备了正常仓鼠和羊瘙痒病因子263K感染的发病仓鼠的全脑匀浆,将两种脑匀浆以不同体积比混合后,分别进行144个循环的直接PMCA和每轮48个循环、共8轮的连续PMCA,用Western blot对PrPSc的扩增情况进行检测。结果显示,与常规的直接PMCA方法相比,连续PMCA能更有效地使低浓度的PrPSc扩增到可检出的水平,表明连续PMCA可以支持羊瘙痒因子263K在体外长期稳定的复制。连续PMCA方法是一种体外高效地扩增PrPSc的方法,有潜力成为一种Prion体外培养方法,用于研究Prion错误折叠和复制机制,以及检测脑组织、外周组织和体液样品中的微量PrPSc。

朊粒蛋白PrP^(Sc)寡聚体的形成与跨膜毒性

朊粒蛋白(prionprotein,PrP)传染致病机制一直是朊粒(prion)研究领域的焦点.由正常型朊粒蛋白(PrPC)向致病型朊粒蛋白(PrPSc)的转变是致病的关键步骤.本文综述了近年来PrPC向PrPSc转变的结构变化特征、PrPSc由单体形成寡聚体的组装机制、以及PrPSc寡聚体的跨膜机制与细胞毒性间的关系等方面的研究进展.

Protein A磁珠检测朊病毒方法的建立

建立Protein A磁珠法检测朊病毒,将朊病毒抗体IH2包被后的Protein A磁珠与蛋白酶K消化过的攻毒小鼠脑组织匀浆液混合,经免疫沉淀缓冲液温和洗脱杂蛋白,再经0.2M甘氨酸将目的蛋白洗脱并且利用聚丙酰胺凝胶电泳检测。通过聚丙酰胺凝胶电泳检测出25KD的目的蛋白带,经与正常未消化的朊蛋白条带相比较,证实检测出朊病毒。Protein A磁珠具有高效特异的与抗体IgG结合的特点,与多克隆抗体混合后可有效结合IgG。该方法较免疫组织化学和Western-blot技术简便快速,且磁珠可以回收再使用,使成本低廉。

三种哺乳动物朊蛋白基因的克隆与分析

以外周血液的总DNA为模板,运用PCR方法克隆了汉族人、秦川黄牛和甘肃土种绵羊的Prnp基因,运用分子生物学软件对这些序列进行了分析比较。结果表明,获得的3种哺乳动物的Prnp基因均位于1个单一的外显子内,与GenBank中登录的相应序列具有高度同源性,达99.0%。牛与绵羊Prnp基因同源性为97.3%,推导氨基酸序列同源性为96.5%。人Prnp基因与黄牛和绵羊Prnp基因的同源性分别为86.7%和87.1%,其氨基酸序列的同源性均为90.0%。3种Prnp基因均有富含G-C的重复区,编码的PrP蛋白均由氨基端的信号肽、中间的成熟蛋白和羧基端的GPⅠ锚结合位点组成。基因型分析表明,秦川黄牛和甘肃土种绵羊可能存在感染海绵状脑病的风险。

毛细管电泳及其在朊病毒检测中的应用

本文简单介绍了毛细管电泳(CE)的发展前景,较详细地综述了毛细管电泳在朊病毒(PrPSc)检测方面的应用。CE作为1990年代末期发展最快的分析化学领域,已经在可传播性海绵状脑病(TSEs)的诊断检测方面显示了特有的优越性,成为目前唯一可以检测血中PrPSc的方法,为实现TSEs的生前诊断提供了新的思路。

羊瘙痒因子263K感染仓鼠终末期脑中胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达和分布变化研究

为了探讨羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中星形胶质细胞和神经元的数量及功能改变,利用免疫印迹、免疫组化方法研究了胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(neuron specificenolase,NSE)在受染仓鼠各脑区中表达变化的特点,同时比较其与神经病理学改变及PrPSc沉积的关系。结果表明,感染终末期仓鼠的脑组织中GFAP表达量明显增高,与正常对照相比,大脑皮质、脑干和小脑区域GFAP着色细胞数量分别增高3 69、2 41和1 56倍。感染仓鼠脑组织NSE表达量低于正常对照,小脑、海马CA1区和大脑皮质NSE着色细胞数量分别仅为正常对照相应区域的22 5%、54 2%和53 9%。这些变化与PrPSc在脑组织中的沉积程度和空泡样变性程度相吻合。结果提示,GFAP和NSE的检测可分别很好地反映星形胶质细胞和神经元的数量及功能状态,成为在朊病毒病发病过程中重要的病理变化指标。

克雅氏病的实验室检测技术研究进展

克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease,CJD)是一种在人类中最为常见的海绵状脑病,其致病因子为朊病毒。由于该病的致死率为100%,且具有传播风险,CJD的早期诊断对疾病防控具有重要意义。临床上一般依据患者的临床症状与体征以及相应的实验室检测来进行CJD的鉴别诊断。本文主要围绕现有的CJD实验室检测技术展开综述,包括朊病毒的直接与间接检测、疾病标志物的检测以及疾病相关基因PRNP的检测与分析等,旨在为进一步推广和规范CJD的实验室检测提供参考与技术依据。

朊病毒疾病将如何发展？

疯牛病是传染性海绵状脑病(朊病毒病)的一种,1985年在英国暴发的疯牛病引起了全世界的关注.发生疯牛病的分子机制是疯牛病病毒诱导细胞型朊蛋白的构象发生变化,从富含?-螺旋的细胞型朊蛋白转变为富含?-折叠的疯牛病病毒,导致这种构象变化的原因目前仍然未知.这类传染性的神经退行疾病目前仍然没有有效的治疗方法.虽然禁止肉骨粉作为动物饲料明显地抑制了疯牛病的进一步流行,但是羊瘙痒病、水貂传染性脑炎和鹿慢性消耗性疾病等朊病毒疾病的流行病学表明朊病毒已经并将持续存在于自然界,而和人类健康息息相关.除朊病毒病外,多种神经退行疾病如阿尔兹海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病等致病的原因都是由蛋白质异构引起的,因此阐明朊病毒疾病的致病机制对于其他神经退行疾病的研究有重要的借鉴意义.本文回顾了几大类传染型朊病毒疾病的发生历史和现状,依据朊病毒的发生及传播特性指出朊病毒疾病不可能被根除并存在暴发的潜在可能.

蛋白质错误折叠循环扩增及其在朊病毒蛋白检测中的应用研究进展

朊病毒蛋白(prion protein,PrP)是传染性海绵状脑病的病原体,其检测是该病诊断的重要依据。该文从原理、方法、影响因素和检测应用方面对蛋白质错误折叠循环扩增(protein mis-folding cyclic amplification,PMCA)这种朊病毒蛋白新型检测技术做了介绍,旨在为朊病毒蛋白的检测和发病机制研究提供理论参考。