乙型肝炎病毒preC/C基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过ＰＣＲ获得长度为６４０ｂｐ的ＨＢＶｐｒｅＣ／Ｃ基因片段，将其克隆入转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３／４，构建出重组质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３／４－ｐＣ／Ｃ。利用共转染的方法，构建出既能形成多角体又能表达ｐｒｅＣ／Ｃ基因的重组毒株ＴｎＮＰＶ－ｐＣ／Ｃ－ＯＣＣ＋。该重组毒株中ｐｒｅＣ／Ｃ基因受到串联的双启动子－合成启动子和含ＨｉｎｄⅢ接头的ＸＩＶ启动子的双重调控。对感染重组毒株的草地夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ，Ｓｆ）细胞及其培养上清分别进行ＨＢｅＡｇ、ＨＢｃＡｇ固相放射免疫检测，发现受感染细胞及其培养上清均呈ＨＢｅＡｇ阳性，ＨＢｃＡｇ阴性；进一步做Ｗｅｓｔｅｒｎ分析表明，受感染细胞总蛋白中２６ｋＤ及培养上清１５ｋＤ处，呈现与ＨＢｅＡｇ单克隆抗体特异性反应条带。结果表明，克隆的乙肝病毒ｐｒｅＣ／Ｃ基因在杆状病毒载体系统中得到正确表达和加工，加工产物能够有效分泌。

HBeAg、抗-HBe、HBV DNA共存与PreC/C基因变异分析

目的分析HBeAg、抗—HBe、HBV DNA共存的产生原因、临床特点。方法 Abbott法检测HBV血清标志物,HBV DNA定量测定,PreC/C基因序列测定。结果本模式76％系HBV慢性感染,24％急性感染,均有活动性肝损害;HBV DNA定量中位数4.57 copies/ml,HBeAg(P/N)32.31±87.81,抗-HBe(P/N)0.55±0.26;PreC基因83,C基因14、104、158、203、233多位点基因变异,并产生2个终止码变异。结论检测灵敏度的提高、宿主免疫反应激活、病毒基因变异是产生本模式的原因。

HBeAg抗-HBe HBV DNA共存与PreC/C基因变异分析

目的 分析HBeAg、抗-HBe、HBV DNA共存的产生原因、临床特点。方法用AbbOtt法检测HBV&清标志物,PreC/C基因序列测定,HBV DNA定量测定。结果本模式76％系HBV慢性感染,24％急性感染,均有活动性肝损害;HBVDNA定量中位数4.57E拷贝/ml,HBeAg(P/N)32.31±87.81,抗-HBe(P/N)0.55±0.26;PreC基因83,C基因14、104、158、203、233多位点基因变异,并产生两个终止码变异。结论检测灵敏度的提高、宿主免疫反庆激活、病毒基因变异是产生HBeAg、抗-HBe、HBV DNA共存的原因。

HBVpreC/C区基因突变与原发性肝癌预后的关系

目的研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)preC/C区基因突变与原发性肝癌患者预后的关系。方法收集81例乙型肝炎病毒相关性肝细胞肝癌(hepatitis B virus associated hepatocellular carcinoma,HBV-HCC)患者的癌组织并提取基因组DNA,对HBVpreC/C区基因进行扩增和测序,并根据NCBI数据库鉴定出其突变位点,运用Kaplan-Meier和Cox回归等方法分析HBV-HCC患者的临床资料、突变位点与其术后生存期之间的关系。结果门脉瘤栓、肿瘤分期和肿瘤大小是与HBV-HCC患者术后生存相关的独立危险因素。1915、2134、2176、2221和2260突变位点被确定为预测HBV-HCC患者生存相关的独立危险因子,1979和2245突变位点与HBV-HCC患者生存具有临界统计学差异。结论门脉瘤栓、肿瘤分期和肿瘤大小以及HBVpreC/C区基因的以上7个突变位点被确定为与肝癌患者术后预后相关的独立危险因素。

HBV prec/c shRNA慢病毒真核表达载体的构建和鉴定

目的构建针对HBV prec/c区的shRNA真核表达载体psiHBV,感染HepG2 2.15细胞后观察其对HBeAg表达的抑制作用,为探讨防治HBV感染的新措施提供实验依据。方法针对HBV prec/c基因序列,构建shRNA表达载体psiHBV1、psiHBV2和无关序列psiHBVc。psiHBV与慢病毒辅助系统质粒共转染293T细胞组装慢病毒颗粒后,感染HepG2 2.15细胞,RT-PCR检测prec/c mRNA的转录,微粒子化学发光分析仪(MEIA)检测细胞上清和细胞裂解液中HBeAg表达。结果重组质粒双酶切和测序鉴定与预期结果相符合;组装慢病毒颗粒感染HepG2 2.15细胞后,prec/c mRNA转录降低;与对照组比较,HBeAg的表达水平也显著降低,病毒颗粒对HBeAg表达的抑制作用差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建针对HBVprec/c的慢病毒载体psiHBV1、siHBV2,慢病毒介导的RNA i能抑制HBV表达,为应用RNA干扰技术治疗乙型肝炎提供了实验依据。

乙型肝炎病毒前C/C区基因变异检测的临床意义

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)前C?C区基因的一级结构及其变异特点。探讨前C区1896位基因突变与血清标志物,肝功能损害的关系。方法:收集慢性乙型病毒性肝炎患者血清388份,进行前C/C区基因测序,HBV标志物、HBV-DNA、ALT、AST测定。结果:HBVA1896突变毒株158例,A1899突变毒株57例。C区变异大部分集中在第5、27、60位氨基酸的序列中。结论:A1896突变与HBeAg分泌障碍有关。A1896突变可加重肝脏损害。

乙型肝炎病毒C基因变异株的体外构建及其生物学意义

目的 了解我国乙型肝炎病毒 (HBV)C区变异的生物学意义。方法 采用酶切位点消除法定点突变构建HBVC基因变异株 (V6 0、G87、L97)真核细胞表达载体 ;转染HepG2 细胞用ELISA法检测各毒株宿主细胞上清液中HBeAg。 结果 与野生毒株相比 ,构建的变异株前C/C区碱基除目的突变点外 ,其他碱基均同源。在重组质粒转染的宿主细胞中检测到目的DNA片段。L97变异株宿主细胞上清液HBeAg的A值在不同时间点均高于野生株和其他变异株 (P <0 .0 0 1) ;G87宿主细胞上清液中HBeAg的A值均为阴性 ,但浓缩 10倍后阳性 ;V6 0宿主细胞上清液中HBeAg的A值与野生株差异无显著性。结论 HBV前C/C区V6 0。