HBV PreS2+S/IFN-α融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建含HBVPrdS2 +S和IFN α融合基因的真核表达载体pcDNA3.1.S2S/IFN α并在真核细胞中进行表达。应用重叠延伸剪切技术 (splicingbyoverlappingextension ,简称SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段S2S/IFN α ,回收后直接克隆到 pcDNA3.1V5 /HisTOPOTA克隆载体 ,得到真核重组载体pcDNA3.1.S2S/IFN α。然后用脂质体法转染VeroE6细胞。对重组载体进行了限制性酶切及PCR鉴定 ,证明连接正确 ;经间接免疫荧光检测证实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。真核表达载体pcDNA3.1.S2S/IFN α的成功构建及在VeroE6细胞中的有效表达 。

HBV preS2S-rhGM-CSF融合基因表达质粒的构建和表达

目的 :研究GM CSF和preS2对乙肝DNA疫苗的免疫增强作用。方法 :采用PCR方法 ,扩增HBVpreS2 +S基因约 84 6bp的片段和rhGM CSF(包括甘氨酸接头 )基因 4 5 0bp的片段。通过T A克隆技术和基因定向克隆 ,构建融合基因的真核表达质粒pcDNA3.1 S2S rhGM CSF ,并在HepG2细胞中表达。结果 :经酶切、PCR及DNA测序鉴定 ,融合基因表达质粒HB VpreS2S rhGM CSF成功地构建。将其转染HepG2细胞后 ,目的基因的转录通过RT PCR得到证实 ,而且表达的融合蛋白能与抗 HBs、抗 preS2和抗 GM CSF单克隆抗体 (mAb)均产生特异性反应。结论 :融合基因表达载体pcDNA3.1 S2S rhGM CSF的成功构建并表达 。

HBV PreS2S/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建含HBV PreS2S和Fc融合基因的真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc并在真核细胞中进行表达. 方法:应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension,简称SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段S2S/ Fc,回收后克隆到pGEM-T Easy TA克隆载体,获得合适的酶切位点,再采用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA3中,得到真核重组载体pcDNA3 S2S/Fc.然后用脂质体法转染SP2/0细胞. 结果:对重组载体进行了限制性酶切鉴定及测序分析,汪明连接正确;经间接免疫荧光捡测证实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白. 结论:真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc的成功构建及在SP2/0 细胞中的有效表达,为进一步探讨HBV感染的特异性免疫治疗提供了实验依据.

IL-2-preS融合基因真核表达载体的构建与鉴定

ＩＬ－２－ｐｒｅＳ融合基因真核表达载体的构建与鉴定汤丽霞马文煜杨晓峰张富泉任君萍（第四军医大学微生物学教研室，西安７１００３２）以往研究表明，诱导保护性免疫的目的基因直接体内转染，能诱导产生抗体及ＣＤ８＋的ＣＴＬ，产生有效免疫保护作用。ｐｒｅＳ具有强...

乙型肝炎病毒preS2蛋白在转基因小鼠肝脏中的表达

目的 :分析乙型肝炎病毒 pre S2蛋白在 3′末端缺失的 pre S/ S基因转基因小鼠肝脏中的分布及其病理学作用。方法 :采用原核显微注射法将质粒 pc DNA3.1- pre S/ St注射入小鼠受精卵雄原核 ,制备转基因小鼠。PCR法在基因组水平筛选 3′末端缺失的 pre S/ S基因转基因小鼠首建者 (founder)及后代 ;免疫组织化学法在蛋白水平检测 pre S2蛋白在这些小鼠中的表达 ;H- E染色分析转基因小鼠肝组织的病理学变化。结果 :经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后 ,共出生 15只新生小鼠 ,其中存活 7只 ,经 PCR检测后获得 2只 founder转基因小鼠 ,命名为 C5 7- Tg N (pre S/ St) SMMU。免疫组织化学检测发现转基因小鼠肝细胞质中有 pre S 2蛋白表达 ,H- E染色发现转基因小鼠肝组织中央静脉周围有淋巴细胞聚集。将这 2只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配 ,进行传代培育 ,PCR法筛选阳性转基因小鼠 ,目前已传至 F2 代。 结论 :本研究成功建立了稳定遗传 3′末端缺失的 pre S/ S基因并表达 pre S2蛋白的转基因小鼠 C5 7- Tg N((pre S/ St) SMMU,它将是体内研究 3′末端缺失的 pre S/

免疫接种后HBV感染者PreS2基因变异的情况

目的:本课题应用PCR和基因测序等技术,观察免疫接种后慢性乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,H B V)感染者的PreS2基因变异情况,进而初步探讨乙型肝炎疫苗免疫失败与P r e S2基因变异之间的相互关系;为进一步探索新的HBV抗病毒基因治疗靶点提供理论基础.方法:收集昆明市延安医院和昆明市第三人民医院免疫接种后慢性HBV感染者的血液标本共47例,从血清标本中提取HBV DNA;用PCR法扩增Pre S2基因片段;扩增后的基因片段进行DNA序列分析.扩增出PCR产物的有35例,上海生工测序最终完成测序的有32例,其中男18例,女14例,年龄19-56岁,平均年龄32.75岁±10.22岁.32份样本的HBV Pre S2基因片段测序后,以Gen Bank数据库中登录号为NC_003977.1的HBV DNA全基因序列为参照,用Chromas软件分析测序图及BLASTN对测序结果进行比对分析后,采用SPSS11.5统计软件进行统计分析.结果:32例标本中Pre S2基因全部出现点突变(100%),其中2例出现缺失突变(6.3%),提示可能存在Ile、Tyr、Phe、Gly、Arg等氨基酸的缺失,32例标本均未发现Pre S2起始密码子ATG的变异,点突变共发生517次,Pre S2基因碱基突变有11种类型:G-A、A-G、T-C、A-T、G-T、C-T、G-C、A-C、C-G、C-A、T-A.11种不同类型的点突变在突变例数率及突变次数率方面均不全相同,其中A-T的突变例数较多,G-A的突变次数较多,差异有统计学意义(P<0.05).Pre S2基因不同部位点突变比较结果显示Pre S2基因前端、中段、末端点突变率不全相同,其中中段(nt45-99),即Pre S2基因的56-110位点突变率较高,前端突变率较低,差异有统计学意义(P<0.05).结论:Pre S2基因变异与免疫失败可能存在相关关系,这将为今后深入研究乙型肝炎疫苗免疫失败的发生机制并用于指导临床实践提供理论基础.同时,进一步确定Pre S2基因变异位点,并针对这些靶点设计相应的基因治疗方法,也可能成为今后乙型肝炎疫苗免疫研究的新方向.

乙型肝炎病毒表面抗原preS2+S基因在Pichia Pastoris酵母系统的分泌表达

拟获得adw2亚型乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原preS2+S基因在PichiaPastoris酵母分泌型表达系统(pPIC9K)的高效表达。实验首先将adw2亚型乙肝病毒表面抗原preS2+S基因重组到分泌型酵母表达载体(pPIC9K)形成表达质粒,电转化酵母细胞KM71,G418筛选多拷贝整合克隆,经甲醇诱导表达并用SDS-PAGE电泳及酶免疫法检测表达产物。经100个克隆筛选获得了表达量较高的表达菌株WC4。该菌株甲醇诱导后细胞上清10倍浓缩SDS-PAGE电泳检测显示,细胞上清中有特异蛋白条带,且第6天表达量最高,表达产物单体分子量为31kD左右。用美国雅培公司AUZYMEMONOCLONAL试剂盒估算表达量为2μg/100OD600细胞。上述结果表明,乙肝病毒表面抗原preS2+S基因在本系统中获得了分泌表达。同时检测了酵母细胞裂解液中特异蛋白质的表达,结果发现,自甲醇诱导后第一天即可检测到表达产物,而且除了第6天细胞外表达量高于细胞内外,其余各天的表达水平均表现为细胞内高于细胞外。以上结果提示,利用分泌型酵母表达系统表达乙肝病毒表面抗原在技术上可行,但表达产量偏低,一些蛋白滞留在细胞内未能分泌到培养基中。

T载体克隆乙肝病毒preS2+S基因的实验研究

将商品化真核表达载体pcDNA3改造成T载体pcDNA3－T，并运用pcDNA3－T直接克隆了由PCR扩增的adw2亚型乙肝病毒preS2与S基因。结果：pcDNA3－T与PCR产物的重组率高达70％。提示：该方法具有简便，省时等特点。

乙型肝炎病毒PreS_2S基因在毕赤酵母中表达的研究

构建重组质粒PHIL-D2/PreS2S以研究乙肝病毒PreS2(120-146)S基因编码蛋白在毕赤酵母中的表达。通过PCR扩增获得PreS2S片段,插入含AOX1启动子的Pichia Pastoris表达载体PHIL-D2中,构建重组表达质粒PHIL-D2/PreS2S,转化酵母宿主菌GS115。挑取阳性克隆摇床培养,甲醇诱导表达。通过ELISA、RPHA鉴定表达产物。成功构建了PHIL-D2/PreS2S真核表达载体,经过序列分析,插入的基因为在中国流行的adr亚型。在毕赤酵母中重组载体表达了S蛋白,S蛋白的表达量为34.9 mg/L,PreS2抗原检测为强阳性。利用毕赤酵母表达系统能够有效地表达乙型肝炎病毒的PreS2S蛋白,PreS2S蛋白具有良好的生物学活性。

乙型肝炎病毒前S2/S与重组人GM-CSF融合基因的分子克隆及鉴定

目的 为探讨乙型肝炎病毒前S2 (preS2 )和粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子(GM -CSF)对乙型肝炎疫苗的免疫增强作用,构建S2 /S(preS2 +HBsAg)与GM -CSF融合基因真核表达载体。方法 采用PCR技术分别扩增出S2 /S大小约846bp的编码基因片段和带有15个甘氨酸接头序列的GM CSF约45 0bp编码基因片段,经T A克隆后分布克隆至载体PcDNA3 .1中,获得PcDNA3 .1 S2 /S GM CSF融合基因表达载体,利用酶切、PCR和DNA序列测定进行鉴定插入片段的大小和方向。结果 经过鉴定该融合基因全长约13 0 0bp ,证实为S2 /S GM- CSF融合基因。结论 乙型肝炎病毒(HBV)S2 /S和GM- CSF融合基因真核表达载体构建成功,为进一步研究其表达和生物学活性奠定了一定基础。

HBV S/HEV ORF2融合基因对番茄的遗传转化

应用重组PCR技术将乙肝病毒(HBV)S基因连接在戊肝病毒(HEV)ORF2部分序列的5′端,二者通过柔性肽(Gly4Ser)2序列相连,构建成融合基因BE。将融合基因BE克隆到植物双元表达载体pBin438上,获得pBin438BE,然后用冻融法将其转入根癌农杆菌EHA105中,侵染丽春番茄子叶和下胚轴,经预培养、共培养、筛选培养、生根培养获得了5株抗卡那霉素的番茄植株。提取抗性植株基因组DNA,进行PCR及PCR-Southern检测,4株获得阳性信号。初步表明目的基因已整合到了番茄基因组中。

融合基因S2S/IFNα对小鼠免疫反应的影响

目的探讨S2S/IFNα融合基因疫苗诱导HBV preS2S特异性体液免疫及细胞免疫应答的作用。方法pcDNA3.1S2S/IFNα作为实验组,设立pcDNA3.1S2S+pcDNA3 IFNα组、pcDNA3.1S2S组及空载体对照组作为对照组,免疫BALB/c小鼠。采用0、2、4周的方案接种,检测各次接种后抗体水平。初次免疫后7周,测定免疫脾细胞的杀伤活性、增殖活性、细胞因子的分泌水平及免疫脾细胞CD25的表达量。结果pcDNA3.1S2S/IFNα组小鼠抗体滴度、免疫脾细胞的杀伤活性和增殖活性、Th1型细胞因子的分泌水平及CD25表达量均比对照组明显增强。结论S2S/IFNα融合基因能诱导更强的特异性体液免疫及细胞免疫应答。

抗HBV Pre S2 3B9单抗轻、重链可变区基因的分离,序列分析及单链可变区抗体基因的构建

3B9单抗是一株抗HBV PreS2抗原的单抗,为从分子水平分析,了解389单抗进而为制备新一代基因工程抗体奠定基础。本文用分子生物学技术,提取389杂交瘤细胞总RNA,经反转录,PCR分离获得了389单抗的轻,重链可变区基因。并利用PCR及双脱氧核苷酸链末端终止法对389单抗的可变区基因的核苷酸序列进行了分析。结果表明,389单抗轻链隶属小鼠Ig

乙型肝炎病毒前S2与α-干扰素融合基因的构建

乙型肝炎病毒前S2(HBV PreS2)基因编码蛋白含55个氨基酸残基,具有聚合人血清白蛋白受体(pHSA-R)活性,是HBV感染嗜肝性的重要机制之一,并在诱导机体产生保护性免疫应答中起重要作用。α-干扰素(IFN-α)是一种多功能免疫调节因子,可诱导机体产生抗病毒蛋白。

乙肝前S2抗原决定簇串联体与核心抗原的基因融合与表达

乙肝前Ｓ２（ＨＢＶＰｒｅＳ２）肽段由５５个氨基酸组成，其Ｎ端肽段含Ｔｈ和Ｂ细胞抗原决定簇，为增强ＰｒｅＳ２的抗原性，本实验采用将化学合成的ＰｒｅＳ２ｅｐｉｔｏｐｅ（１２０－１４５）基因以串联方式与ＨＢｃＡｇ的基因进行了融合，融合基因在大肠杆菌中获得表达，并通过ＥＬＩＳＡ比较研究了融合蛋白中ＰｒｅＳ_２ｅｐｉｔｏｐｅ单体及串联体的抗原性差异。

乙型肝炎病毒表面抗原S和前S1融合基因转基因细胞系的建立与细胞性质的研究

构建了 pCHBSSIG质粒 ,其特点是CMV立即早期启动子调控乙型肝炎 (乙肝 )表面抗原S +前S1融合基因在前 ,SV40早期启动子调控GS扩增基因在后 ,此质粒转化到CHO dhfr-细胞中 ,经克隆加MSX及MTX筛选、扩增 ,建立了 7个高效表达乙肝表面抗原S及前S1融合蛋白细胞系GdSS1,并检测了其中GdSS1 18细胞系的生物学特性 ,结果表明 :未发现微生物污染 ,无致瘤性 ,遗传稳定 ,电镜下可观察到 2 2nm的颗粒 ,纯化后的蛋白在SDS PAGE及Westernblot中显示出特异性的 2 7kD、30kD乙肝表面抗原S和前S1的融合蛋白带。主蛋白的反向被动血凝(RPHA)滴度为 1∶2 5 6～ 1∶5 12 ,前S1蛋白的ELISA滴度为 1∶12 8。

海莲耐盐基因AOC克隆及转录融合表达载体的构建

利用RT-PCR的方法从红树林海莲中克隆丙二烯环化氧化酶基因(AOC),并进行序列测定和BLAST程序进行同源序列分析。从RT-PCR得到的产物,其核苷酸序列与GeneBank中海莲丙二烯环化氧化酶基因AO(CBAB21610)的核苷酸序列完全相同。AOC基因通过中间载体pBS-AOC,pJIT60-AOC,最后克隆到植物表达载体pGreenII0229上,得到双35S的pGreenII0229-AOC植物表达载体。AOC基因和ipt基因通过中间载体pBS-AOC,pBS-ipt,pBS-AOC-ipt,pJIT60-AOC-ipt;最后将AOC和ipt基因以转录融合的方式克隆到植物表达载体pGreenII0229上,得到具有双35S启动子的AOC,ipt双基因转录融合的植物表达载体pGreenII0229-AOC-ipt。

重组质粒pcDNA3.1S2S/Fc在小鼠诱导免疫反应的观察

目的探讨S2S/Fc融合基因疫苗诱导小鼠HBV preS2S特异性体液和细胞免疫应答情况。方法取pcD-NA3.1S2S/Fc、pcDNA3.1S2S+pCMVsFc、pcDNA3.1S2S和空载体对照免疫BALB/c小鼠。在免疫动物2、4和6周后检测血清抗-HBs水平;在初次免疫7周后,测定免疫脾细胞的杀伤活性、增殖活性及细胞因子的分泌水平。结果经pcDNA3.1S2S/Fc免疫小鼠6周抗体滴度升至最高,免疫脾细胞的杀伤活性在效靶比为20:1时最高,免疫脾细胞的增殖活性以及IL-2和IFN-γ的分泌水平均比对照组明显增高。结论S2S/Fc融合基因在小鼠能诱导很强的特异性体液和细胞免疫应答。

IBDV VP2蛋白在果蝇S2细胞中的表达与抗原性分析

利用果蝇S2细胞表达鸡传染性囊病病毒(IBDV)超强毒株VP2蛋白,并检测其抗原活性。通过扩增IBDV VP2蛋白的编码基因,与果蝇S2细胞表达载体pMT/BiP/V5/HisA连接构建重组表达载体pMT/BiP/V5/HisA-VP2,将重组表达载体与筛选质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,表达VP2融合蛋白后纯化目的蛋白,并对表达产物进行抗原性分析。Western-blotting分析表明,融合蛋白相对分子质量为49 kDa,该融合蛋白具有与VP2单抗良好的结合能力。结论 IBDV VP2融合蛋白能在果蝇S2细胞中进行有效地表达,并且能分泌到上清中,融合蛋白具有良好的抗原性,可作为诊断抗原用于该病的诊断检测。

猪圆环病毒2型结构蛋白Cap在果蝇S2细胞中稳定表达与鉴定的研究

为了表达猪圆环病毒2型(PCV-2)结构蛋白Cap并检测其表达情况,试验采用果蝇S2细胞真核表达的方法,通过扩增PCV-2 Cap蛋白的编码基因,与昆虫细胞表达载体pMT/Bip/V5-HisA连接构建重组表达载体pMT/Bip/V5-HisA-Cap,用重组表达载体与筛选质粒pCoHygro共转染S2细胞,再使用选择性培养基加压筛选出稳定的细胞株,表达Cap融合蛋白后,利用SDS-PAGE及Western-bolt研究表达产物的抗原性。结果表明:融合蛋白的分子质量约为31 ku,该蛋白能够与带有V5标签的抗体结合,说明PCV-2 Cap蛋白能在S2细胞中正确表达,并具有良好的抗原性。