In-vitro Maturation of Immature Oocytes from Preantral Follicles in Prepuberal Mice

Objective To observe the morphological changes in in vitro growth of preantral follicle isolated from prepuberal mice and to assess impacts of gonadotropin （Gn）, insulin transferrin selenium （ITS） and epidermal growth factor （EGF） on their development. Methods Early preantral mice follicles （90-130μm diameter） were mechanical isolated and selected from 2 weeks＇ old mice and then cultured in alpha-minimal essential medium （α-MEM） with or without Gn, ITS and EGF. The preantral follicles were cultured singly in 20 miovliters droplets for up to 14 d. The medium was replaced and the .follicles were observed everyday. Granulosa cells （GC） prolification, antrum formation and oocyte maturation were recorded. Results The medium with Gn supported preantral follicle culture in vitro, during which they retained a three-dimensional structure, maintained oocytes viability and increased in diameter and number of somatic cells＇. Preantral follicles cultured in Gn medium grew obviously, while those without Gn grew slowly and after 6 d＇s culture began to shrink and blacken. Significant increase in survival rate and maturation rate of oocytes was observed in Gn group （P〈0.01）, with 92.9% survived and 28.7%formed an antrum. Further supplementation of the Gn medium with ITS and rLH, resulted in the significant increase in survival and maturation of preantral follicle （P〈0.05） Conclusions α-MEM can be the medium for in vitro culture （IVC） of preantral follicles, but need to be added with rLH/rFSH, rHCG/rEGF to facilitate thecal cell attachment, GC proliferation and oocyte maturation.

小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长、体外成熟、体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于添加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟。单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用。将体外受精后发育至２—细胞的胚胎移植入受体鼠，胚胎可以正常着床发育。同时，卵母细胞的核仁和线粒体在培养过程中也发生相应的变化。

不同条件对绒山羊体外培养初级毛囊生长的影响(英文)

[Objective] The aim of this study is to lay a foundation for illustrating the biological characteristics and growth regulation mechanism of hair follicles.[Method]Cashmere goat primary hair follicles were separated under aseptic condition and cultured in serum-free DMEM and serum-free Williams E media respectively;subsequently,the growth rate and morphological changes were observed under the inverted microscope.[Result]Hair follicles cultured in serum-free DMEM media showed a growth rate of 0.034 mm/d during the first 3 days,whose structure and morphological characteristics could maintian a stable status for a long time in the growth process.Hair follicles grew much faster in the serum-free Williams E media with a growth rate of 0.077 mm/d during the first 3 days.[Conclusion]There were significant differences(P<0.05)between the growth of cashmere goat hair follicles cultured in the 2 kinds of media.Serum-free Williams E medium was superior to serum-free DMEM medium.

牛腔前卵泡的体外培养

通过在α- MEM和 D- MEM/ F1 2 基础液中添加不同比例的 ITS、丙酮酸钠、谷氨酰胺、次黄嘌呤和血清 ,观察了不同基础液对牛腔前卵泡体外生长发育的影响 ,从而筛选出较好的组别。在筛选出的基础液组别中添加 3个水平的FSH、L H、E2 ,观察了其对牛腔前卵泡体外生长发育的影响。结果表明 ,α- MEM和 D- MEM/ F1 2 2种基础液中以α-MEM为好 ,不同的基础培养液组合对牛腔前卵泡的体外培养有一定的影响。添加不同水平的激素对牛腔前卵泡体外培养也有显著影响。试验初步筛选出最佳的培养液成分为α- MEM+ITS(I- 5 m g/ L ,T- 5 mg/ L ,S- 5μg/ L ) +丙酮酸钠(0 .2 3mmol/ L) +谷氨酰胺 (1.5 m mol/ L) +次黄嘌呤 (2 m mol/ L) +血清 (7.5 % ) +FSH(0 .2 5 mg/ L) +L H(5 IU/m L ) +E2 (0 .5 mg/ L )。

小鼠腔前卵泡不同分离方法的比较

目的探讨小鼠腔前卵泡的最佳分离方法。方法取性未成熟小鼠的卵巢,按照不同分离方法,单纯机械法与酶解法分离腔前卵泡,并用基础培养基进行培养,比较不同分离方法获得的卵泡数量、形态,及对其早期生长发育的影响。结果2mg/mL的胶原酶可获得大量基底膜完整的腔前卵泡及裸卵(P<0.01);体外培养2d后,酶解组卵泡生长直径大(P<0.05)、GVBD率、放出第一极体率和7d生存率无明显差异(P>0.05)。结论胶原酶酶解法较单纯机械法更易获得大量高质量腔前卵泡,且对其早期发育无明显影响。

体外培养牛腔前卵泡卵母细胞的超微结构

直径约100μm牛腔前卵泡在无血清下体外培养15d。超微结构研究显示,培养前腔前卵泡卵母细胞微绒毛短小,分布均匀。胞质内细胞器致密而均匀,线粒体多为长或圆形,嵴较少,高尔基体、脂滴稀少,未见有皮质颗粒出现。培养6d时,微绒毛略变粗长,但数量减少。胞质内细胞器,由近核分布向胞质中央区转移,线粒体形态丰富,基质电子密度极高。培养15d腔前卵泡卵母细胞微绒毛增多,变长,斜向或垂直插入已经形成的透明带中。线粒体增多,大小不等,形态各异,胞质中区有溶酶体样物质及零星的皮质颗粒出现。电镜研究表明,体外培养与体内正常发育腔前卵泡卵母细胞超微结构变化规律基本相似。

小鼠腔前卵泡体外发育和体外排卵的研究

为探明小鼠腔前卵泡体外发育及体外排卵的特征和规律性 ,为利用卵巢资源奠定基础 ,采用机械方法分离未成熟小鼠腔前卵泡进行体外培养 .以 α- MEM加亚硒酸钠、维生素 C,L-谷氨酰胺、丙酮酸钠为基础培养液 ,分组添加 10 %的 2种不同来源的血清和 1μg/ m L FSH.在多卵泡培养体系中 ,培养 9～ 10 d,每天观察其体外发育情况 ,测定卵泡和卵母细胞大小 .培养结束时 ,用 h CG进行体外诱导排卵 .结果表明 :体外培养过程中 ,腔前卵泡贴附培养皿底 ,相互聚集粘附形成团状结构 ,在细胞铺层微滴培养中 ,卵泡呈单个生长 ,并发育形成卵泡腔或腔样结构 ;经9d体外培养 ,小鼠腔前卵泡达到排卵前大小 (>40 0 μm) ,卵母细胞从开始时的 5 3.2 μm生长到 6 8.0～ 70 .8μm,总存活率为 6 1.0 % ;卵母细胞的大小及存活率在不同的血清添加组间差异不显著 ;用 h CG可诱导体外排卵 ,发生卵泡破裂 ,卵母细胞排出 ,卵丘细胞扩展 ,卵母细胞生化泡破裂 ,放出第一极体 .总排卵率达 5 9.5 % .因此 ,采用多卵泡培养体系 ,小鼠腔前卵泡能够发育至成熟排卵 .

骨形态发生蛋白-4对人始基卵泡的作用

【目的】观察骨形态发生蛋白-4(BMP-4)对人卵巢组织体外培养中始基卵泡存活和生长发育的影响。【方法】34例卵巢组织切成2mm×2mm×1mm皮质片,每例标本的皮质片均随机分成3组:研究组(BMP-4组)、对照组和非培养组,培养15d后行组织学检查、雌孕激素测定和凋亡分析。【结果】培养结束后对照组和研究组始基卵泡比例分别为58%±35%和48%±40%,低于非培养组(91%±9%),P<0.05;窦前卵泡比例分别为52%±40%和42%±35%,高于非培养组(9%±9%),P<0.05。研究组间质细胞凋亡指数和培养液孕激素浓度分别为(0.16±0.08)μg/L和(3.6±2.0)μg/L,低于对照组,对照组分别为(0.41±0.16)μg/L和(6±4)μg/L(P<0.05)。【结论】BMP-4可以促进始基卵泡向窦前卵泡转化,降低细胞凋亡率,抑制孕激素分泌,是卵泡生长发育过程中的促进因子。

山羊腔前卵泡卵母细胞体外发育与体外成熟的研究

通过比较 3种培养基、5个培养系统和 4种培养方法对卵母细胞生长率的影响 ,结果发现 ,就卵母细胞生长率而言 ,以MEMHEPES培养液 +5%FCS +40 μg/mlFSH +2 0ng/mlIGF- 1+2mmol/LcAMP +2mmol/L次黄嘌呤培养系统为佳。在腔前卵泡体外培养过程中 ,12个卵泡经腔期发育 ,约占同等培养条件下卵泡总数的 2 % ( 12 / 60 3)。培养卵泡经腔期发育 ,并未改善其卵母细胞的成熟率 ( 0 / 12 )。腔前卵泡卵母细胞经过不同时间的体外培养 ,发现经 12和 14d培养结束的卵母细胞中 ,有 81% ( 4 7/ 58)生发泡明显迁移至质膜下 ;培养 14d的卵母细胞中 ,约 16 4 %( 9/ 55)产生 pbI但不排出 ,因而可在胞质中见到极体 ;培养 16d得到 1枚排出 pbI的孤雌激活卵 ;同时发现培养 16～ 18d卵母细胞退化率明显增高 (P <0 0 1)。推测山羊腔前卵泡卵母细胞体外培养的适宜时间为 16d。

不同培养基对山羊毛囊体外培养的影响研究

为得到1种简捷而适宜的山羊毛囊体外培养方法，采用3因子3水平的拉丁方正交试验设计（I9（3^4））方法，对比研究了无血清的Williams培养基、无血清的DMEM培养基和添加10％FCS（胎牛血清）的DMEM培养基，及其在3种培养基中分别添加0、2和10ng/mL3种不同质量浓度的血管内皮细胞生长因子（VEGF）和表皮细胞生长因子（EGF）时对毛囊体外培养的影响。将成年青山羊皮肤上的单根毛囊完整地分离出来，并同时平行培养在9种培养基中，借助于倒置显微镜和目镜测微尺随时不断地观察毛囊生长的形态变化和测量毛根的长度。结果发现：山羊游离毛囊在9种培养基中均能很好地生长；但以无血清的培养基和在WilliamsE培养基的效果最好；分别和同时添加2％～10％的VEGF和EGF时可加快毛囊的生长；添加10％FCS和不添加细胞生长因子时毛囊也能生长，但生长速度较慢。

新生大鼠卵巢体外培养体系的研究

目的:探讨最适宜于大鼠原始卵泡体外生长发育的培养体系。方法:取出生2d的SD大鼠卵巢,分别在Waymouth和DMEM中培养8d,石蜡制片,HE染色,统计分析各级正常卵泡数;于培养d4、d8观察各级卵泡形态;并用免疫组化方法检测在这两种培养体系的卵巢中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达定位情况。结果:①在Waymouth中,由原始卵泡启动生长成为初级卵泡和次级卵泡的百分率分别是25.51%和6.93%,高于DMEM中的17.06%和3.56%(P<0.01)。②在Waymouth中培养的卵泡形态都较正常,而在DMEM中培养的异常卵泡较多。③PCNA作为原始卵泡生长的指标,也说明卵巢在Waymouth中能良好生长。结论:Waymouth培养体系是研究原始卵泡生长的一个理想的培养体系。

离体培养条件下神经生长因子对毛囊的影响

目的 观察神经生长因子 (nervegrowthfactor,NGF)对离体培养条件下的人头皮毛囊生长的影响。方法 在离体人头皮毛囊培养模型中 ,加入 10 0 μg·L -1的NGF ,测量毛囊长度的变化以及 2 4hDNA合成率。结果 目镜测微器观测 10 0 μg·L -1的NGF与 12 5mg·L-1的米诺地尔一样能明显地促进游离的人头皮毛囊生长 (P <0 .0 5 ) ,尤以前 8d较为明显 ;3 H TdR掺入检测的DNA合成率亦明显增高。结论 10 0 μg·L

小鼠腔前卵泡体外培养成熟-染色体分析技术的建立

背景与目的：初级卵母细胞生长过程中对理化因子反应敏感，拟建立小鼠腔前卵泡体外培养成熟（IVG）一染色体分析技术，为生殖毒理学提供有效的检测模型。材料与方法：采用机械分离法从12～14日龄昆明小鼠的卵巢中分离出直径为140—160μm的腔前卵泡，单个卵泡放入微液滴培养体系中，隔天半量换液，连续培养10d，对成活卵泡体外诱导超排，于16～24h后，检测卵母细胞成熟情况，分别计数停滞在生发泡期（GV）、生发泡期破裂（GVBD）和排出第一极体（PB）的卵母细胞数，对卵母细胞进行染色体数目与结构分析，并与体内发育体外成熟卵母细胞（IVM）及体内超排成熟卵母细胞（IVC）进行比较分析。结果：从4只小鼠卵巢中分离得到332个腔前卵泡，培养早期卵泡直径增长显著，随后呈“摊鸡蛋”样生长，部分形成假腔。培养10d后存活率为95．78％（318／332），激索诱导排卵后，卵丘-卵母细胞复合体排出率72．01％（229／318），其中11．80％（27／229）停滞在GV期，39．30％（90／229）发生GVBD，47．16％（108／229）发育成熟，排出第一极体（PB），1．74％（4／229）发生孤雌活化。IVG与IVM、IVC两种方法获得的卵母细胞染色体对比分析，未见明显的染色体数目与结构异常。结论：小鼠腔前卵泡体外培养成熟，可获得与体内生长相同的成熟卵母细胞，染色体分析未见异常，可成为一种良好的生殖毒理学体外检测与卵泡发育机制研究模型。

不同浓度的FSH对猪腔前卵泡体外培养的影响

为确定不同浓度的FSH对猪腔前卵泡体外培养的影响,探讨最佳培养体系,比较了M199培养液中3种FSH浓度(0.5、1、2IU/mL)对腔前卵泡体外培养的影响。结果表明:FSH浓度为2IU/mL时腔前卵泡的生长率最高,2 IU/mLFSH与0.5IU/mLFSH相比,在卵泡生长率、成腔率和存活率上都存在着显著差异(P<0.05)。3个处理组腔前卵泡前5d生长率与后5d相比差异极显著(P<0.01)。结论:高浓度的FSH能显著地促进腔前卵泡的生长和腔的形成,且能够提高腔前卵泡的成活率。猪腔前卵泡体外培养呈前高后低的生长模式。

动态添加FSH对绵羊卵巢皮质组织体外培养的影响

本研究旨在探索促卵泡素(FSH)对体外培养绵羊卵巢原始卵泡和组织活性的影响。通过稳定或动态方式添加不同浓度FSH(1、10、50、100ng·mL-1),用组织学和免疫组化PCNA方法来评估FSH对体外培养绵羊卵巢皮质组织中原始卵泡激活、生长、存活以及颗粒细胞增殖活性的影响;此外通过测定培养液中雌激素含量,评估卵巢组织体外培养过程中活性的保持。结果表明,先升后降动态添加FSH对于卵泡发育、存活和生长以及颗粒细胞的增殖具有全面的促进作用;同时组织分泌雌激素能力也高于其他组。以稳定方式添加时,50ng·mL-1FSH在培养1d时显示对卵泡发育的显著促进作用(P<0.05),添加10ng·mL-1以上浓度的FSH可以促进卵泡存活和生长(P<0.05)。在整个培养期内,各培养组中雌激素产量持续增加,说明卵巢活性在本培养体系中可以得到很好的维持。本试验结果表明FSH可能参与早期卵泡的发生,动态添加FSH更有利于体外培养卵泡的发育和组织活性的维持。

人卵巢组织冷冻保存的实验研究

目的 :探讨冷冻保存对人卵巢皮质内各级卵泡形态及对组织体外培养的影响。方法 :取手术切除的 30例患者的卵巢皮质 ,放入二甲基亚砜配制的冷冻保护液中 ,应用程序冷冻法保存于液氮内。冷冻前后取部分卵巢皮质行组织学检测 ;同时培养部分组织块观察上清中雌二醇分泌的变化。结果 :冷冻后存活的始基卵泡 ,与新鲜组比较无显著改变 (P >0 .0 5 ) ,初级卵泡的存活率显著下降 (P <0 .0 5 ) ;而冷冻保存不会明显降低始基卵泡与初级卵泡总的存活率 (P >0 .0 5 )。复温后卵巢组织中仅见 1枚形态正常的次级卵泡。冷冻后培养上清中雌二醇水平与新鲜组比较无明显差异 (P >0 .0 5 )。结论 :程序冷冻法可以较好地保存人卵巢皮质内的始基卵泡 ,且不影响冷冻后卵巢组织的激素分泌。

珊瑚姜提取物对C3H/He小鼠毛发生长周期及其对小鼠触须毛囊体外培养的影响

目的:探讨中药珊瑚姜对C3H/He小鼠毛发生长周期及其对小鼠触须毛囊体外培养的作用。方法:采用体外局部直接给药的方式,观察珊瑚姜提取物对C3H/He小鼠毛发生长的影响。结果:肉眼观察19d以后,2.0%珊瑚姜用药组小鼠毛已全部长满,0.5%珊瑚姜用药组小鼠也有长毛,较空白组多而长,毛色较空白对照组深,生长速度明显加快,提前进入生长期(P<0.05)。病理切片显示用药15d后,用药组动物皮肤真皮层黑素分布较多,毛发处于生长期,而空白对照组黑素分布较少,毛发大多处于休止期。结论:珊瑚姜提取物具有明显的促毛发生长作用。

激活素A对离体培养大鼠卵泡发育的影响

激活素A是一种由卵泡液中提取出来的蛋白 ,主要以旁分泌和自分泌途径调节卵泡颗粒细胞功能 ,而对卵泡发育的影响却不十分清楚。本实验目的旨在探讨激活素A对大鼠离体培养卵泡发育的影响。用胶原酶分离窦前卵泡并分别加入激活素A(140 μg/L)、FSH(0 1IU/mL)以及卵泡抑素 (FS)在DMEM培养液中进行离体卵泡培养 4d ,观察卵泡直径、雌二醇分泌的变化。结果表明 :激活素A处理组和FSH +激活素处理组的卵泡直径显著增大 (P <0 0 1)。FSH +激活素A处理组雌二醇的分泌显著增加。FS可抑制激活素A对卵泡发育的影响。结果显示

雌二醇对体外培养绒山羊初级毛囊的影响(英文)

[Objective] The aim of this study was to preliminarily explore the effects of estradiol on morphology and growth of cashmere goat primary hair follicles. [Method] Cashmere goat primary hair follicles were cultured in serum-free Williams E media supplemented with different doses of 17 β-E2 (0, 0.1, 1.0, 10.0, 100.0 nmol/L), and their growth rates and morphological changes were observed. [Result] The growth rate of 0.1 nmol/L 17 β-E2 group was quite comparable with that of the control group(0 nmol/L), but the 17 β-E2 with concentrations of 1.0, 10.0 and 100.0 nmol/L displayed different degrees of inhibition on the growth of hair follicles. Different morphological changes of hair follicles could also be discovered in different concentration treatments. [Conclusion] The study laid a certain foundation for exploring the regulation mechanism of estrogen on growth of cashmere goat hair follicles.