可诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株的构建

目的:构建受强力霉素诱导表达脑啡肽的大鼠星形胶质细胞株(IAST).方法:应用分子克隆技术构建含人前脑啡肽原基因(hPPE)的逆转录病毒四环素反应质粒(pRe-vTRE/hPPE);以脂质体转染法将重组质粒pRevTRE/hPPE和调节质粒pRevTet-On分别转染入包装细胞PT67,分别收集病毒上清;将含有RevTet-On病毒上清感染IAST,挑选单克隆并瞬时转染报告质粒pRevTRE-Luc,通过检测萤光素酶活性,挑选出强力霉素诱导表达高、背景表达低IAST/Tet-On细胞株;再将RevTRE/hPPE病毒上清感染IAST/Tet-On细胞株,得到稳定表达脑啡肽的IAST/Tet-On/hPPE细胞株,通过RT-PCR、免疫细胞化学及间接免疫荧光染色检测该细胞株中强力霉素定量调控脑啡肽的表达.结果:重组逆转录病毒载体pRe-vTRE/hPPE构建成功;经挑选得到了高表达、低背景IAST/Tet-On细胞株,其诱导倍数为20.6;在IAST/Tet-On/hPPE细胞株中,hPPE基因表达受强力霉素调控,呈剂量依赖关系.结论:成功构建了受四环素及其衍生物强力霉素定量调控表达脑啡肽的永生化IAST,为可调控基因治疗慢性疼痛的研究奠定了基础.

2Hz和100Hz电针加速脑内三种阿片肽基因表达

我室以往的工作证明2Hz和100Hz电针可引起中枢释放不同种类的阿片肽，本工作试图阐明不同频率的电针是否影响三种阿片肽的基因转录。用地高辛标记的反义cRNA探针进行原位杂交，显示大鼠脑内前脑啡肽原（preproenkephalin，PPE），前强啡肽原（preprodynorphin，PPD）和前阿黑皮素原（proopiomelanocortin，POMC）mRNA。结果：（1）低、高频电针均不影响POMCmRNA的水平。（2）对PPE的影响，两种频率电针诱导脑干网状结构头端腹内侧区PPEmRNA升高的幅度相似，2Hz电针诱导视上核、视交叉上核、下丘脑室分核、弓状核、腹内侧核反外侧丘系核的PPEmRNA表达比100Hz电外高得多。（3）对PPD的表达，2Hz电针不改变脑内PPDmRNA的水平，100Hz电针可使现上核、下丘脑室旁核、腹内侧核及脑干臂旁核的PPDmRNA明显升高。鉴于肽类的加速释放必然引起合成的增加，上述结果为不同频率电针加速不同内源性阿片肽的释放和合成，从而发挥镇痛作同，提供了有力的佐证。

强力霉素诱导表达脑啡肽细胞株的构建及其对慢性神经痛大鼠的镇痛作用

目的构建受强力霉素诱导表达脑啡肽的永生化大鼠星形胶质细胞株,并评价鞘内移植该细胞对慢性坐骨神经压榨性损伤(CCI)大鼠的镇痛效应。方法应用逆转录病毒转染法,建立受强力霉素调控表达人前脑啡肽原基因(hPPE)的永生化大鼠星形胶质细胞株(IAST/Tet-On/hPPE),实时定量PCR及放射免疫分析法检测强力霉素对该细胞株脑啡肽表达的定量调节。将IAST/Tet-On/hPPE细胞植入CCI大鼠蛛网膜下腔,观察腹腔注射强力霉素对其镇痛效应的影响及免疫组织化学检测脊髓背角Fos蛋白的表达。结果实时定量PCR及放射免疫分析结果显示,强力霉素可定量调控IAST/Tet-On/hPPE细胞株中脑啡肽的表达;IAST/Tet-On/hPPE植入CCI大鼠的蛛网膜下腔后,大鼠机械缩爪阈值升高(P<0.05),脊髓背角浅层Fos蛋白表达明显降低(P<0.05),且该镇痛效应受强力霉素调控。结论成功构建了可调控的定量表达脑啡肽的永生化星形胶质细胞株,其有望成为慢性疼痛治疗的新方法。

大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠δ阿片受体(delta opioid receptor,DOR)基因小发卡RNA(shRNA)及人前脑啡肽原基因(hu-man preproenkephalin gene,hPPE)双表达慢病毒载体并鉴定。方法根据大鼠DOR mRNA序列设计shRNA并合成包含正、反义靶序列的互补DNA链,退火后插入至shRNA表达载体pENTR/U6vector中,构建shRNA表达质粒,并转化至感受态细胞DH5α,抽提质粒后进行测序。合成hPPE基因序列并插入到表达载体pcDNA3.1(+)中,转化至感受态细胞DH5α,挑取多个单克隆进行测序验证。将hPPE插入已构建成功的pENTR/U6-shRNA载体中,再与慢病毒载体pLenti7.3/V5-DEST重组,构建慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA并转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆并测序验证,保留测序验证正确的LR重组质粒。用构建的慢病毒表达载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,并测定滴度。结果经测序验证重组质粒pENTR/U6-shRNA、pcDNA3.1(+)-hPPE和慢病毒载体pLenti-CMV-hPPE-U6-shRNA均构建成功。大鼠δ阿片受体基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒包装成功,病毒滴度为1×107 TU/mL。结论大鼠DOR基因小发卡RNA及人前脑啡肽原基因双表达慢病毒载体构建成功,为研究DOR和hPPE在吗啡耐受中的作用机制及探求更加合理的镇痛方式奠定了基础。

pIRES-GFP-前脑啡肽原载体在体内外的表达及生物学效应

目的检测pIRES-GFP-前脑啡肽原载体在体内外的表达,以探索脑啡肽基因镇痛的生物学效应与临床应用的可行性。方法将大鼠前脑啡肽原基因与绿色荧光蛋白真核质粒连接构建重组质粒,体外转染机体细胞,通过阳性细胞绿色荧光表达的强弱与细胞上清液脑啡肽水平的放射免疫测定,观察重组质粒在细胞内的合成与表达;大鼠蛛网膜下腔注射重组质粒,观察大鼠热痛阈值的变化,确定重组质粒在机体细胞内合成外源性脑啡肽的生物学活性。结果体外试验表明重组质粒转染24 h后COS-7细胞内开始有绿色荧光表达,48 h达高峰,持续27 d开始减弱,动物实验大鼠热痛阈值的变化与体外试验基本相符。结论重组质粒在机体细胞内合成的外源性脑啡肽具有与内源性脑啡肽相同的生物学活性,可以作为一种长效的基因镇痛方法应用于临床。

Plv-UbC-HPPE/HEK293细胞对骨癌痛大鼠镇痛作用及其机制的探讨

目的观察鞘内注射稳定表达人前脑啡肽(HEEP)的HEK293细胞对骨癌痛大鼠痛觉的影响,探讨其与脊髓背角蛋白激酶Cγ(PKCγ)表达的关系。方法选取40只雌性SD大鼠,随机分为4组:Naive组,CIBP组,CIBP+HEK293组,CIBP+HPPE组,每组10只。对CIBP组,CIBP+HEK293组,CIBP+HPPE组造骨癌痛模型。模型建立成功后,分别对CIBP+HEK293组和CIBP+HPPE组大鼠鞘内注射Ubc-GFP-L.V/HEK293细胞和Plv-UbC-HPPE/HEK29细胞。术前1d和从术后3d开始每隔3天测定各组大鼠的热缩足反射潜伏期(PWTL)。使用免疫组织化学法检测大鼠脊髓背角PKCγ的表达。结果鞘内注射细胞后,CIBP+HPPE组大鼠各时点PWTL较CIBP组和CIBP+HEK293组明显升高(P<0.05)。CIBP+HPPE组大鼠脊髓背角PKCγ的蛋白表达量明显低于CIBP组和CIBP+HEK293组大鼠(P<0.05)。结论鞘内注射Plv-UbC-HPPE/HEK293细胞使骨癌痛大鼠疼痛明显减轻,其镇痛作用可能与抑制脊髓背角PKCγ的蛋白表达有关。

冰茶栓治疗海洛因依赖猴的基因表达研究

目的 :研究中药复方戒毒制剂冰茶栓对海洛因依赖猴戒断症状及基因表达的影响。方法 :猕猴经海络因皮下注射 72天建立依赖模型 ;并将海洛因依赖猴共 14只 ,分 4组 ,NS组 (3只 ) ,阳性对照组 (3只 ) ,高剂量组 (4只 ) ,低剂量组 (4只 )。在冰茶栓治疗组与未经冰茶栓治疗组及正常组 ,各取猴大脑纹状体组织 ,经RNA抽提纯化 ,采用Cy5、Cy3荧光标记 ,与受体相关基因芯片杂交筛选差异表达基因。结果 :海洛因依赖猴在自然戒断时 ,前脑啡肽原基因发生上调表达 ,而经冰茶栓治疗后 ,此基因表达下调 ,白细胞抗原SB(DP)基因表达上调。结论 :海洛因依赖猴经冰茶栓治疗后 ,戒断症状明显改善 ,并造成基因表达改变。提示 :冰茶栓减轻戒断症状与恢复脑啡肽水平及提高白细胞抗原、增强免疫功能有关。

人前脑啡肽原基因在体细胞系细胞的表达

目的 检测人前脑啡肽原基因 (hppe)鼠、犬、人体细胞系细胞的表达水平 ,评估转脑啡肽基因细胞系用于细胞镇痛的可行性。方法 采用磷酸钙共沉淀法或脂质体包裹法 ,将重组质粒pCMVhPPE(pE)单独或与pRSVneo(pN)共转染导入三种哺乳动物体细胞系细胞 (NIH 3T3,MDCK ,WISH)中。用G418培养液筛选阳性共转染细胞 ,扩增培养。以放射免疫法测定细胞培养上清液中脑啡肽 (ENK)的含量。结果 双质粒共转染加G418筛选所获转化细胞的ENK分泌量 10～ 2 0ng 10 5 个细胞明显高于 pE质粒单转染者的 4～ 6ng 10 5 个细胞 (P <0 0 1)。两者的基因瞬时表达水平无显著性差异 (P >0 0 5 )。双质粒共转染时 ,脂质体包裹法和磷酸钙共沉淀法的基因转染率相仿 ,前者的转染率和表达水平为 0 1%和 13～ 2 0ng 10 5 个细胞 ,后者为 0 0 8%和 6～ 10ng 10 5 个细胞 ,两者无显著性差异 (P >0 0 5 )。结论 hppe基因能在体细胞系细胞中良好表达 ,转化细胞的ENK分泌量(10 7～ 10 9个细胞 )可以满足大鼠脊髓镇痛的需要。

转前脑啡肽原基因镇痛的研究进展

脑啡肽是内源性阿片肽物质之一，具有镇痛、免疫调节、生长抑制等功能，适合慢性疼痛的治疗。本文就脑啡肽的生物学特性及转前脑啡肽原基因在慢性疼痛中的应用作一综述。