GLP-1-Fc融合蛋白在DG44细胞中的表达及其质量分析

构建GLP-1-Fc蛋白真核表达载体,并在DG44细胞株中实现表达。利用基因工程等方法构建表达GLP-1-Fc融合蛋白的重组DG44细胞株,通过甲氨喋呤的加压筛选及有限稀释法挑选出表达量较高的单克隆细胞株,经无血清驯化培养获得悬浮生长的细胞株。收集发酵培养上清,通过离心、过滤及亲和层析等方法对目的蛋白GLP-1-Fc进行分离纯化,并利用Dot blot、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱法、Edman降解等方法进行目的蛋白的质量分析,以建立GLP-1-Fc融合蛋白发酵、纯化工艺,探索该融合蛋白的质量检测方法。本实验成功构建了表达GLP-1-Fc融合蛋白的重组DG44悬浮型细胞株,通过该工艺流程,GLP-1-Fc融合蛋白表达量达到400 mg/L,纯度达95%,分子量约为3.0×10~4。该生产工艺能够获得与理论目标蛋白相一致的、且结构稳定GLP-1-Fc融合蛋白,其质量检测方法稳定可靠。

新的生长激素释放激素类似肽Pro-hGHRH(1-44)-Gly-Gly-Cys的重组和比较活性(英文)

目的:为了寻找高活性和长半衰期生的GHRH类似肽。方法:通过使用独特的酸敏感水解位点Asp-Pro的原核表达系统,构建了新的Pro-hGHRH(1-44)-Gly-Gly-Cys类似肽。通过重组细菌裂解、包含体洗涤、乙醇分级沉淀、酸水解、SP-SephadexC-25和SephadexG-10柱层析等技术,纯化了高纯度的Pro-hGHRH(1-44)-Gly-Gly-Cys肽。通过使用SDS-PAGE、离子化质谱、雌大鼠垂体和人流产胎儿垂体,测定了多肽的纯度、分子量、生长激素释放活性。结果:Pro-hGHRH(1-44)-Gly-Gly-Cys肽分子量5373Da与实际值吻合,0.1～10μg/ml的肽剂量不论是对人垂体还是大鼠垂体都增加了垂体生长激素的释放,大鼠垂体生长激素的释放具有剂量依赖性。与标准的hGHRH(1-40)肽比较,新的类似肽有较高的GH释放活性。结果也显示了,Pro-GHRH(1-44)Gly-Gly-Cys与Pro-hGHRH(1-44)肽的GH释放活性无统计学差异。结论:新的类似肽有较好的生长激素释放活性、功能选择性和种属特异性。

表皮生长因子、C1q/TNF相关蛋白3及骨代谢水平与上肢骨折愈合的相关性

目的探究表皮生长因子(EGF)、C1q/TNF相关蛋白3(CTRP3)及骨代谢水平与上肢骨折愈合的相关性。方法前瞻性选取2019年6月至2023年11月西安交通大学附属红会医院收治的90例上肢骨折患者为研究对象,根据术后6个月骨折愈合情况分为正常愈合组(n=67)、延迟愈合组(n=23)。对比两组患者EGF、CTRP3及骨代谢相关指标[β-Ⅰ型胶原羧基端肽(β-CTx)、可溶性黏附分子CD44(sCD44)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)]水平。采用多因素Logistic回归分析影响上肢骨折患者正常愈合的因素;采用受试者操作特征(ROC)曲线分析EGF、CTRP3、β-CTX、sCD44、FGF-2对上肢骨折正常愈合的预测价值。结果术后7 d,两组患者EGF、CTRP3水平均较术后1 d升高,且正常组患者EGF、CTRP3水平分别为(0.98±0.16)、(217.85±51.05)pg/mL,均高于延迟组[(0.87±0.12)、(144.62±41.95)pg/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。术后7 d,两组患者β-CTX、sCD44、FGF-2水平均较术后1 d升高,且正常组患者的β-CTX、FGF-2水平分别为(0.82±0.26)ng/mL、(30.00±7.65)ng/L,均高于延迟组[(0.61±0.15)ng/mL、(25.67±7.26)ng/L],而sCD44水平为(283.20±24.17)ng/mL,低于延迟组[(312.66±33.25)ng/mL],差异均有统计学意义(P<0.05)。经多因素Logistic回归分析,术后7 d EGF、CTRP3、β-CTX、sCD44、FGF-2表达均为影响上肢骨折患者愈合的独立危险因素(P<0.05)。经ROC曲线分析,术后7 d的EGF、CTRP3、β-CTX、sCD44水平表达均对上肢骨折患者正常愈合有较高的预测价值,曲线下面积(AUC)值分别为0.719、0.868、0.741、0.812。结论上肢骨折正常愈合患者EGF、CTRP3、β-CTX、FGF-2水平高于延迟组,而sCD44低于延迟组,EGF、CTRP3、β-CTX、sCD44水平表达均对上肢骨折患者正常愈合有较高的预测价值。