多重RT-PCR一步法技术同时检测猪瘟病毒和蓝耳病病毒方法的建立以及初步应用

猪瘟病毒和蓝耳病病毒均能导致猪繁殖障碍,对养猪生产影响很大。根据猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病(PRRS)的基因保守序列设计了2对针对这2种病毒的特异引物,并建立了多重RT-PCR方法,分别对其最佳反应条件、特异性及敏感性进行了测定,结果表明能同时扩增得到2条与试验设计相符的167bp(CSFV)和320bp(PRRS)特异性条带,同时具有较好的特异性;敏感性检测结果表明,临床阳性的样品提取的核酸稀释1000倍后仍能检测出CSFV和PRRSV。本方法的建立对于这2种病毒病的早期快速检测具有十分重要的意义。

丙三醇缩水甘油醚改性脱细胞猪真皮基质的研究

研究了丙三醇缩水甘油醚（GPE）改性脱细胞猪真皮基质材料（pADM）的基本性能．通过考察不同温度、pH值、用量和反应时间对改性材料（GPE-pADM）性能的影响，初步探讨了改性条件与改性材料性能之间的关系．实验结果表明：反应温度37～42℃，pH值10．0～10．5，反应时间48-72h，用量8％时综合性能较好．交联后材料的接触角明显降低，且随着GPE用量的增加，接触角降低程度增大，表明交联提高了材料的亲水性能．

非融合膜外型猪卵透明带-3β蛋白在原核系统中的表达

目的:通过基因工程的方法在原核表达系统中表达去除了信号肽和跨膜区的膜外型猪卵透明带蛋白pZP3β。方法:设计适宜引物,采用PCR方法,在基因水平对膜外型pZP3β的翻译起始序列进行适当调整,获得的基因克隆入pET-3c载体,并进一步在大肠杆菌E.coli BL21(DE3) pLysS中表达。结果:得到表达率约10%的非融合膜外型pZP3β蛋白的表达,并经Western-blot鉴定为目的蛋白。结论:外源蛋白在不改变氨基酸序列条件下,在基因水平的适当调整可以有效提高其表达率。

我国两个不同地区猪繁殖和呼吸综合征病毒分离株ORF5基因序列比例

To elucidate the characteristics of molecular epidemiology of PRRSV in China, the nucleotide sequence of open reading frame 5 (ORF5) coding regions from two wild PRRSV strains, J1 and S1, isolated in northern and mid-eastern regions of China was determined by RT-PCR. Comparison showed that only 4 different bases between J1 and S1 strains resulted in 3 amino acid (aa. )changes in their deduced proteins. There were 3 and 2 different aa. between the deduced aa. sequences of J1, S1 strains and the American prototype ATCC virus VR2332 respectively, while there existed 16 and 15 aa. changes between the 2 isolates and the modified live vaccine strains derived from VR2332. The putative protein molecular weight, isoelectric point, signal region, glycosylation site and possible transmembrane helices of ORF5 of each strains were similar to that of VR2332 strain. These results showed that the two isolates belong to the same genotype and they may come from USA.

猪生殖-呼吸道综合征国内分离毒株的病毒纯化及其结构蛋白分析

本研究主要对猪生殖呼吸道综合征（ Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ） 国内分离毒株（ Ｃ Ｈ Ｉａ） 进行了病毒纯化及其结构蛋白的分析。选用聚乙二醇（ Ｐ Ｅ Ｇ６０００） 沉淀和差速离心法粗提了经 Ｍａｒｃ１４５ 细胞系增殖的猪生殖呼吸道综合征病毒（ Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ） 。并采用非线性蔗糖密度梯度离心法纯化了 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ， 经免疫电镜观察纯化病毒， 发现有较多的胶体金颗粒吸附在直径为４２ ～７８ｎｍ 的病毒粒子周围。经 Ｄｏｔ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定纯化病毒的滴度可达１ １６００ 以上， 并利用 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 两种方法对国内分离毒株（ Ｃ Ｈ Ｉａ） 与欧洲型（ Ｌｅｌｙｓｔａｄ） 、美洲型（ Ｖ Ｒ２３３２） 等参考毒株的病毒结构蛋白组成和部分抗原特性进行了初步的研究。测得国内分离毒株主要结构蛋白的分子量为１４５ Ｋ Ｄ，１９２ Ｋ Ｄ 和２６３ Ｋ Ｄ， 并均能被 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 的高免血清识别， 这与国外的同类报道很相似。

甘氨酰谷氨酰胺对猪离体骨骼肌卫星细胞增殖和分泌IGF-1的影响

为探讨甘氨酰谷氨酰胺(Gly Gln)对猪离体骨骼肌卫星细胞增殖和分泌IGF 1的作用,取10日龄仔猪的半腱肌和背最长肌,将分离出的半腱肌卫星细胞和背最长肌卫星细胞分别按2×10 5mL-1密度接种于培养板上,采用浓度为0 6、1 2和2 4mmol/L的Gly Gln处理离体培养的猪半腱肌和背最长肌卫星细胞,观察Gly Gln对离体骨骼肌卫星细胞增殖和分泌IGF 1的影响.结果表明:用上述浓度的Gly Gln处理细胞,对离体培养的猪半腱肌卫星细胞的增殖有显著促进作用(P <0 0 5 ) ,而对离体培养的猪背最长肌卫星细胞的增殖有极显著的促进作用(P <0 0 1) ;同时发现:添加0 6mmol/LGly Gln对猪背最长肌卫星细胞分泌IGF 1有显著的促进作用,提示:不同浓度的Gly Gln对猪离体骨骼肌卫星细胞的增殖均有促进作用,但不同部位的骨骼肌卫星细胞对Gly

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株基因组全长cDNA克隆的构建

猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)嗜好在PAM和其他单核细胞上生长 ,如果把PRRSV作为一种病毒活载体 ,它就可以携带外源抗原高效进入猪体的免疫系统 ,更好地刺激机体产生免疫应答。本实验根据PRRSV基因组和克隆载体的限制性内切酶酶切位点 ,将PRRSV基因组设计为 8段进行了反转录和扩增 (RT_PCR) ,将得到的片段克隆到质粒pBluescriptIISK(_)或pMD 18T_vetcor中。在扩增 5’端时 ,运用 5’RACE获得了基因组 5’最末端序列 ,在亚克隆入pOK12前在 5’端上游引入了T7启动子序列。选取一个克隆在 3’端紧挨ORF7下游引入了PacⅠ位点 ,以期作为感染性分子克隆的分子标志。将扩增片段在pBuescriptIISK(_)中进行了部分连接后 ,亚克隆于低拷贝质粒pOK12中 ,在pOK12中进行了长片段的连接 ,并获得了基因组全长cDNA克隆。进行全基因测序后 ,在 3处发现有 6个核苷酸的缺失 ,运用插入突变修补丢失的碱基 ,最终获得了含有PRRSVCH_la株基因组全长cDNA的重组质粒pOKCH_laF和含有分子标志PcaⅠ的基因组全长cDNA克隆pOKCH_laPacIF。在本试验中构建的基因组全长cDNA克隆为进一步获得具有感染性的PRRSV分子克隆并研究该病毒基因组结构和功能奠定了基础。

美拉德反应修饰改善猪血浆蛋白抗氧化肽功能特性的研究

研究主要探讨美拉德反应修饰对猪血浆蛋白抗氧化肽功能特性的影响。采用D-半乳糖对猪血浆蛋白抗氧化肽进行美拉德修饰,蛋白质和糖的比例为1??3(W/W),在90℃水浴中分别加热0、1和6 h,得到美拉德反应产物(MRPs),测定其溶解性、表面疏水性、乳化性及乳化稳定性、起泡性及起泡稳定性。结果表明,经美拉德反应修饰后猪血浆蛋白抗氧化肽的功能特性有明显改善,其溶解性、乳化及乳化稳定性、起泡及起泡稳定性均随反应时间增加而逐渐增大(P<0.05),表面疏水性则随反应时间增加而降低(P<0.05)。同时,MRPs功能特性随体系中p H的改变而显著变化(P<0.05)。因此,采用美拉德修饰改善猪血浆蛋白抗氧化肽功能特性,可使其广泛应用于食品加工业。

猪胰脏多酶联产实验研究

胰脏是提取胰岛素及多种酶的原料，为提高产率及高度综合利用，作者采用酸、碱抽提、硫酸铵分级沉淀、膜过滤、色谱分离等技术，从１ｋｇ猪胰脏中同时分离纯化酶达９种之多，而各酶的比活力及总活力分别为：胰蛋白酶１６０００ＢＡＥＥＵ／ｍｇ蛋白，２８．４×１０￣６ＢＡＥＥＵ；弹性蛋白酶１２０Ｕ／ｍｇ蛋白，６０００Ｕ；缓激肽酶４０．３８Ｕ／ｍｇ蛋白，３８７６Ｕ；胰凝乳蛋白酶２２０００ＡＴＥＥＵ／ｍｇ蛋白，１９．５×１０￣６ＡＴＥＥＵ；胰蛋白酶抑制剂２０８９Ｔ．Ｉ．Ｕ／ｍｇ蛋白，３１７２７Ｔ．Ｉ．Ｕ；羧肽酶Ａ９．５Ｕ／ｍｇ蛋白，３９８８Ｕ；羧肽酶Ｂ１５４．８Ｕ／ｍｇ蛋白，３４６７５．２Ｕ；核糖核酸酶Ａ８０ＫｕｎｉｔｚＵ／ｍｇ蛋白，８００Ｕ；脱氧核糖核酸酶１１３７．８Ｕ／ｍｇ蛋白，１０６０００Ｕ，本法经多次优选优化而成，建立了简易合理的工艺流程，为充分利用资源，降低成本，建立工业化生产开辟了新的途径．

猪血浆蛋白水解物对水包油型乳状液氧化稳定性的影响

本实验主要研究了猪血浆蛋白水解物(Porcine plasma protein hydrolysate,PPPH)对水包油型(O/W型)乳状液储藏过程氧化稳定性的影响。分别将PPPH以0、2.5、5、10和20 mg/m L的浓度添加到以Tween-20为乳化剂的菜籽油O/W型乳状液中,测定乳状液在37℃条件下储藏10 d时间内的荧光光谱分析、共轭二烯(Conjugated diene,CD)和硫代巴比妥酸值(Thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)的变化趋势。研究结果表明,色氨酸的氧化降解发生在蛋白氧化的初级阶段,而荧光蛋白氧化产物(Fluorescent protein oxidation products,FP)的形成是蛋白氧化第二阶段的产物。另外,在乳化体系储藏期间,与对照组相比,添加2.5 mg/m L PPPH的处理组具有最高的色氨酸荧光强度和FP(p<0.05),同时具有最低的CD和TBARS值(p<0.05)。与此同时,色氨酸荧光强度与CD含量和TBARS值之间呈现显著的负相关关系。总之,PPPH的添加能够显著提高O/W型乳状液的氧化稳定性,为其作为抗氧化剂在乳状液食品中的潜在应用奠定了理论基础。

猪传染性胃肠炎病毒核衣壳蛋白(N)在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的观察

利用RT-PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)核衣壳蛋白N基因,将其克隆入杆状病毒供体质粒pFastBacTMDual,pFastBacTMDual-N转入DH10Bac菌中进行同源重组,经三重抗性和蓝白斑筛选,得到重组质粒Bacmid-N,将其转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rBac-N.通过间接免疫荧光试验检测显示,重组蛋白在昆虫细胞中得到表达.体外组装TGEV病毒样颗粒(VLPs)试验表明,rBac-N单独感染sf9细胞未见形成明显的病毒样颗粒,昆虫细胞内只观察到杆状病毒粒子.试验结果为探讨TGEV核衣壳蛋白在病毒装配过程中的作用提供了依据.

猪卵透明带-3β蛋白核心片断在E.coli中的表达

目的:探讨通过基因工程的方法在大肠杆菌中表达猪卵透明带蛋白pZP3b的核心片断。方法:采用PCR方法扩增原cDNA中编码第44-306个氨基酸的pZP3β核心片断的DNA序列,克隆入pET-3c载体进而在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pLysS中表达。结果:表达的pZP3β核心蛋白占菌体总蛋白的15%,并经Western-blot鉴定为目的蛋白。结论:pZP3β核心片断在大肠杆菌中获得较高的表达,有利于产物的纯化,为后续阐明pZP3β核心区域的性质和相关抗生育研究打下了基础。

褪黑素提高热应激猪卵母细胞的质量

为了研究热应激对猪卵母细胞成熟的影响，以及热应激过程中培养基添加褪黑素是否能够缓解生理过高热对卵母细胞的损伤，试验对体外成熟过程中（0～2h）的卵母细胞进行热应激（41℃），并在成熟培养液（M199）中添加褪黑素（1×10-9mol／L），对其后期发育和囊胚细胞数、囊胚细胞凋亡进行检测。结果表明：热应激能够显著降低猪卵母细胞的囊胚率和囊胚细胞数，囊胚细胞凋亡率显著升高，而添加褪黑素后能够缓解热应激对卵母细胞的影响。说明热应激能够影响卵母细胞的成熟，并对卵母细胞的后期发育产生影响，同时在培养液中加入浓度为1×10-9mol／L的褪黑素能够缓解热应激损伤。

猪ifitm基因克隆及其序列和组织表达分析

为了研究ifitm基因的功能,本研究从猪肾PK15细胞中克隆了猪的3个ifitm c DNA序列,分析了猪ifitm1、ifitm2和ifitm3基因的染色体定位及其与其他物种基因序列的同源关系,并对不同ifitm在不同组织的表达进行分析和检测。结果显示,猪ifitm和人、鼠ifitm具有相同的基因和蛋白结构,进化上与牛ifitm高度同源,ifitm1和ifitm3在脾、肾、心、肝等组织中大量表达,而ifitm2只在脾和肾中检测到表达,在其他组织中的表达量相对较小。猪ifitm基因的克隆、生物信息学及组织表达分析为进一步研究其在猪细胞中的功能奠定了基础。

7株猪圆环病毒2型福建分离株全基因组序列分析

根据已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列,分段设计2对PCV2特异性引物,用PCR方法扩增近年从福建省部分发病猪场分离鉴定的7株PCV2的全基因序列并进行比对分析.结果表明:7株PCV2基因组全长1767 bp,与GenBank上发表的17株PCV2参考毒株的同源性为94.7%-99.5%;7株PCV2分离株之间的全基因同源性高达98.4%-99.5%;7株PCV2 ORF2编码蛋白均具有很强的亲水性和抗原性,其核苷酸及推导的氨基酸同源性高达98.9%-99.7%和97.9%-99.6%,与参考毒株的同源性分别为91.1%-99.7%和85%-100%,存在一定的差异.可见,7株PCV2在基因水平上差异不显著,在地域分布上也没有明显差异.

PRRSV天津分离株Nsp2基因的克隆和遗传进化分析

从天津市病猪中分离得到3株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),分别命名为TJ-S1、TJ-S2和TJ-S3。根据GenBank中PRRSV BJ-4株的基因序列设计并合成针对Nsp2基因高变区的引物,RT-PCR扩增目的基因并将其克隆到pGEM-T载体进行测序,并与国内外已发表的毒株序列进行比较。结果表明,3个毒株都是美洲型PRRSV,而且TJ-S1、TJ-S2株的Nsp2基因发生30个氨基酸的不连续缺失;基因系统发育树分析表明,TJ-S1株、TJ-S2株与HuN株、SD-14株的亲缘关系很近,TJ-S3株与CH-1a株的亲缘关系较近。

Ca(OH)_2和Hoshino制剂对猪牙乳头细胞增殖的影响

目的 :研究Ca(OH)2和Hoshino制剂(甲硝唑、环丙沙星、米诺环素混合制剂)对体外培养的猪牙乳头细胞(procine dental papilla cells,p DPCs)增殖的影响,探讨临床使用牙髓血管再生治疗时根管消毒药物的选择。方法 :将第4代p DPCs分别在含不同浓度Ca(OH)2(10%、1%、0.1%)和Hoshino制剂(0.5%、0.1%、0.05%)的培养基中培养,采用CCK-8法检测2种药物对细胞增殖活性的影响,采用SPSS19.0软件包对实验结果进行统计学分析。结果 :Ca(OH)2对p DPCs细胞的增殖影响呈波动状,细胞培养9 d时,各组浓度Ca(OH)2对细胞增殖无影响;Hoshino制剂可抑制p DPCs的增殖。结论 :实验中各浓度组Ca(OH)2制剂对p DPCs细胞的增殖无影响,而Hoshino制剂可抑制p DPCs细胞的增殖。

基因重组大肠杆菌表达截短型pZP3β的发酵条件优化

目的:对已构建好的表达pZP3β蛋白(pZP130)工程菌的培养条件进行优化,通过在5L罐中发酵和Ni柱纯化,以期获取较大量目的产物。方法:在摇瓶中改变不同的培养及诱导条件,比较工程菌的生长和目的蛋白的表达,优化发酵条件;并在5L发酵罐中进行发酵,获得菌体,破碎后进行Ni柱纯化。结果:优化的发酵条件是:10%的接种量,加入2%甘油的培养基培养菌体3h后加入0.5mmol/LIPTG,诱导4h后收样。在5L发酵罐中发酵,获得菌体量36g/L,经Ni柱纯化,获得蛋白粗制品33mg/L发酵液。结论:截短型pZP3β蛋白可以在E.coli中获得较高表达,并且可以通过发酵和Ni柱纯化得到较大量的蛋白,这有助于pZP的深入研究和应用。

重组猪乳铁蛋白N端多肽对环磷酰胺免疫抑制小鼠免疫功能的影响

研究旨在观察重组猪乳铁蛋白N端多肽(rPLFN)对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠免疫功能的影响。选用体重18～21g的雄性ICR小鼠40只,按试验要求随机分成4组,即12.5mg/kg rPLFN组、25mg/kgrPLFN组、环磷酰胺组和对照组,每组10只;按设计剂量灌胃给药,在第12天时用环磷酰胺50mg/kg腹腔注射建立小鼠免疫低下模型,至第16天检测各组小鼠脾淋巴细胞增殖反应和血清IL-2、TNF-α、IFN-γ含量。结果表明:25mg/kg rPLFN组能拮抗环磷酰胺对小鼠脾淋巴细胞增殖反应的抑制作用(P<0.05);25mg/kg rPLFN组血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α含量显著高于模型组(P<0.05)。结果表明,rPLFN对环磷酰胺免疫抑制小鼠的免疫功能有一定的恢复和增强作用。

异种器官移植:前景如何?

目前异种器官移植在进入临床的过程中存在两大难题———免疫排斥和病原微生物感染 .人类为防止免疫排斥而采取的措施使超急性排斥得到了很大程度的避免 ,但大大增加了器官移植受体感染病原微生物的机会 .猪作为人类理想的器官供体 ,却有多种内源性病毒 ,其中猪内源性逆转录病毒 (PERV)引起了人类较大的关注 .PERV的跨种感染存在正、反两方面的证据 。