传代培养PC12细胞的分泌特性及PENK基因表达的研究

目的观察PC12细胞传代培养中的生长情况,检测培养液中去甲肾上腺素(NE)和甲硫氨酸脑啡肽(M-EK)的分泌水平及细胞前脑啡肽(PENK)基因的表达情况,为细胞移植镇痛的研究提供实验依据。方法PC12细胞在DMEM+15%胎牛血清中培养,酶法消化传代;采用高效液相色谱-电化学检测法检测培养液中NE的浓度;采用放射免疫法检测培养液中M-EK的浓度;采用反转录PCR检测细胞PENK mRNA的表达。结果传代培养PC12细胞的基础分泌:NE为(465.8±78.5)pg/mL,M-EK为(4.3±0.66)pg/mL;PENK低水平表达。结论PC12细胞在传代培养过程中,可合成和分泌NE和M-EK,并可检测到PENK基因的表达,为细胞移植镇痛提供新的细胞来源。

海马结构内PENK和PDYN基因表达之间关系的探讨

目的 :探讨海马结构内PENK和PDYN基因表达之间的关系。方法 :合成一段与PENKmRNA起始部位互补的 39merAntisense ,同时分别合成PENKmRNA的Sense序列和Missense序列。将三段寡核苷酸硫代化后 ,用微渗透泵通过脑内给药的双通不锈钢管 ,分别将其恒速持续注入清醒自由活动大鼠的一侧腹侧海马结构内 ,并用原位杂交技术观察海马内PENKmRNA和PDYNmRNA的表达。结果 :灌注Antisense侧海马内PENKmRNA的表达较对侧明显降低 ,而PDYNmRNA却较对侧明显增高 ;灌注Sense和Missense的大鼠两侧海马内PENKmRNA和PDYNmRNA的表达未见明显差别 ,提示Antisense选择性阻断PENKmRNA表达后 ,同侧PENKmRNA表达降低的同时PDYNmR NA表达明显增加 ;同时发现对侧PENKmRNA表达增加的同时PDYNmRNA的表达明显降低 ,并且反义寡核苷酸的作用具有序列特异性。结论 :PENKmRNA的表达能抑制PDYNmRNA的表达 。

表达载体pEGFP—C3一PENK的构建以及在NIH3T3细胞中的表达

目的：构建质粒pEGFP-C3-PENK,并观察其在真核细胞中表达的时效.方法：构建质粒pEGFP-C3-PENK;低浓度裸质粒、高浓度裸质粒、脂质体介导分别转染NIH3T3细胞,观察转染率、绿色荧光蛋白表达情况;放射免疫法和免疫细胞化学法检测脑啡肽的表达情况.结果：质粒pEGFP-C3-PENK成功构建;低浓度裸质粒转染率5%;高浓度裸质粒转染率8%,脂质体介导转染率为20%;转染5周后仍有绿色荧光蛋白表达.结论：成功构建质粒pEGFP-C3-PENK,可在NIH3T3细胞中表达超过5周.

颈动脉超声联合血浆脑啡肽原A水平检测在缺血性脑卒中患者颈动脉狭窄诊断中的临床价值

目的 探讨颈动脉超声联合血浆脑啡肽原A(PENK-A)水平检测对缺血性脑卒中(ICS)患者颈动脉狭窄程度的诊断价值。方法 收集2019年1月至2022年1月联勤保障部队解放军第九六〇医院收治的103例ICS患者的临床资料,根据颈动脉狭窄程度将患者分为轻中度狭窄组(n=75)与重度狭窄组(n=28)。所有患者均进行了颈动脉超声检查,并检测了颈动脉血流动力学参数[颈内动脉阻力指数(ICA-RI)、搏动指数(PI)、舒张末期流速(EDV)、收缩期峰值流速(PSV)]。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定血浆EPNK-A水平。通过受试者工作特征(ROC)曲线分析颈动脉血流动力学参数、血浆PENK-A单独及联合检测对ICS患者颈动脉狭窄程度的诊断价值。结果 经数字减影血管造影(DSA)检查,103例ICS患者中,轻中度狭窄组75例,重度狭窄组28例。重度狭窄组患者的ICA-RI、PI及血浆PENK-A水平均明显高于轻中度狭窄组患者,EDV、PSV水平均明显低于轻中度狭窄组患者,差异均有统计学意义(P<0.01)。ICA-RI、PI、EDV、PSV与血浆PENK-A联合检测对ICS患者重度颈动脉狭窄的诊断价值最高,曲线下面积(AUC)为0.978,灵敏度为99.2%,特异度为88.0%。结论 颈动脉超声联合血浆PENK-A水平检测对ICS患者颈动脉狭窄程度的诊断价值较高。

散偏汤对偏头痛模型大鼠中脑、三叉神经节CGRP、PENK基因、蛋白表达的影响

目的观察散偏汤对偏头痛模型大鼠中脑、三叉神经节降钙素基因相关肽(CGRP)、PENK(PENK)基因、蛋白表达的影响。方法 24只健康SPF级SD大鼠随机分为4组:生理盐水组、偏头痛模型组、琥珀酸舒马普坦组、散偏汤组。颈背部皮下注射硝酸甘油连续3周复制实验性偏头痛动物模型,第2次注射硝酸甘油后给予药物干预,1周后,第3次注射硝酸甘油2 h后取材,Western blotting法测定三叉神经节CGRP、PENK蛋白表达变化;实时聚合酶链反应PCR(Real-time PCR)检测各组大鼠中脑CGRP、PENK基因表达变化。结果 Western blotting法检测:偏头痛模型组大鼠三叉神经节中CGRP蛋白表达与生理盐水组差异有统计学意义(P<0.05),与琥珀酸舒马普坦组和散偏汤组差异有统计学意义(P<0.05),舒马普坦组与散偏汤组差异有统计学意义(P>0.05);偏头痛模型组三叉神经节PENK蛋白表达较生理盐水组降低(P<0.05),散偏汤组和琥珀酸舒马普坦组干预后PENK蛋白表达升高,与模型组差异有统计学意义(P<0.05);Real-Time PCR检测:偏头痛模型组大鼠中脑CGRP基因表达与生理盐水组差异有统计学意义(P<0.05);与琥珀酸舒马普坦组和散偏汤组差异有统计学意义(P<0.05);偏头痛模型组中脑PENK蛋白表达较生理盐水组降低(P>0.05),散偏汤组和琥珀酸舒马普坦组中脑PENK基因表达与模型组比较升高(P<0.05)。结论散偏汤可以抑制伤害性感受传导通路中CGRP的基因及蛋白表达,升高三叉神经节中PENK蛋白的表达,对偏头痛大鼠CGRP基因及蛋白的表达起抑制作用,能抑制痛觉信息的传递,并对内啡肽系统的镇痛作用有一定影响。

平肝止痛颗粒对偏头痛(肝阳上亢型)大鼠血浆中ET、PENK含量的影响

目的观察平肝止痛颗粒对肝阳上亢型偏头痛大鼠的镇痛效果,探讨其治疗偏头痛的作用机制。方法使用附子法和硝酸甘油法制作肝阳上亢偏头痛大鼠模型,通过酶联免疫法检测大鼠血浆中内皮素(ET)、前脑啡肽原(PENK)含量。结果平肝止痛颗粒高、中剂量组均能明显减少ET含量,与模型组比较差异显著。头痛宁和平肝止痛颗粒中剂量组可以减少PENK含量,与模型组比较有明显差异。结论平肝止痛颗粒可以有效降低肝阳上亢型偏头痛,其作用机制可能与降低血浆中ET、PENK的含量有关。

重组质粒pVAX1-PENK大规模制备研究

目的：建立质粒pVAX1-PENK的大规模制备2--艺。方法：对大肠杆菌工程菌DH5α-pVAX1-PENK进行补料发酵，利用自行发明的连续碱裂解过程对菌体进行裂解，经超滤浓缩后，用Sepharnse 6 Fast Flow层析柱分离DNA与RNA，再经Plasmidselect Xtra层析柱分离超螺旋质粒DNA与开环或线性质粒DNA，最后经Source 15Q层析柱精制质粒DNA。结果：发酵获得质粒pVAX1-PENK的产率为182mg／L，经碱裂解及层析分离后，最终制备的质粒DNA超螺旋比例大于98％，总回收率为60.5％，纯度（D260nm／D280nm）为1.8～2.0。结论：建立的质粒DNA生产工艺可以制备大量高纯度的质粒DNA，并避免了使用动物源性的酶及有毒试剂。

不同间隔时间电针对佐剂性关节炎大鼠炎症局部前阿黑皮素和前脑啡肽原mRNA表达的影响

目的:观察不同间隔时间电针对佐剂性关节炎(AA)大鼠的镇痛效应,以探讨针刺镇痛的最佳间隔时间和作用机制。方法:将96只大鼠随机分为对照组、模型组和电针组,每组再分为3 h、6 h、12 h和24 h小组,以Freund’s完全佐剂造成AA大鼠模型,电针选取悬钟和昆仑穴,分别以3 h、6 h、12 h和24 h作为治疗间隔时间,连续治疗6 d,以痛阈、炎症局部前阿黑皮素(POMC)mRNA和前脑啡肽原(PENK)mRNA表达作为观察指标。结果:间隔24 h电针能显著提高AA大鼠的痛阈;不同间隔时间电针均能促进炎症局部POMC mRNA和PENK mRNA的表达。结论:间隔24 h电针可明显提高对AA大鼠的镇痛效应;不同间隔时间电针镇痛效应与促进炎症局部阿片肽基因表达有关。

电针后不同时间佐剂性关节炎大鼠炎症局部阿片肽基因表达的变化

目的:从时效关系角度观察电针对佐剂性关节炎(AA)大鼠镇痛后效应随时间延续的变化规律,并探讨电针镇痛后效应的产生机制。方法:以Freunds完全佐剂造成AA大鼠模型,在电针治疗后1h、3h、6h、12h、24h和48h观测大鼠痛阈、炎症局部前阿黑皮素(POMC)和前脑啡肽(PENK)mRNA的表达。结果:电针治疗后1h、3h、6h、12h,大鼠的痛阈提高,炎症局部的POMC和PENKmRNA的表达增强。结论:电针对AA大鼠镇痛有明显的后效应,可延续12h以上,且后效应的产生与大鼠炎症局部的POMC和PENKmRNA表达增强有关。

cAMP反应序列结合蛋白及其家族与转录调节

ｃＡＭＰ反应序列结合蛋白（ｃＡＭＰ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＥＢ）经磷酸化激活后，可参与ｃＡＭＰ诱导的多种靶基因的转录调控。新近研究表明，ＣＲＥＢ的转录调节作用可能是通过ＣＲＥＢ结合蛋白（ＣＲＥＢ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＢＰ）实现的。在神经系统中，ＣＲＥＢ可能介导神经递质诱导的基因表达，并能通过放大神经营养因子的信号，参与神经细胞增殖、分化、存活等生物效应。

全蝎抗癫痫发作敏感性的阿片肽机制

红藻氨酸（ＫａｉｎｉｃＡｃｉｄ，ＫＡ）癫痫模型，探讨全蝎抗癫痫发作敏感性长期增强的阿片肽机制。本实验选用ＳＤ大鼠，随机分为两组，分别给予生理盐水（ＮＳ）和全蝎粗提液灌胃１０天，１０天后两组均分别颈部皮下注射ＮＳ和惊厥剂量（１０ｍｇ／ｋｇ）的ＫＡ，再分别继续给予ＮＳ和全蝎粗提液灌胃１０天后，用阈下剂量（５ｍｇ／ｋｇ）的ＫＡ检测癫痫敏感性；用Ｆｏｓ免疫反应活性检测海马结构中神经元的兴奋性；用原位杂交技术检测海马脑啡肽原（ＰＥＮＫ）ｍＲＮＡ的动态变化过程。结果显示：实验对照组大鼠癫痫行为敏感性明显增强，脑内癫痫敏感性相关脑区海马齿状回颗粒细胞（ＤＧＣｓ）ｃ－Ｆｏｓ免疫反应阳性细胞数目明显增加，同时海马内具有致癫痫作用的脑啡肽原（ＰＥＮＫ）ｍＲＮＡ表达也明显增加；而实验组动物未见上述改变。本工作证实中药全蝎有明显降低海马神经元兴奋性及抗癫痫发作敏感性形成的作用。

CCK-8与内源性阿片系统在吗啡依赖中的相互作用

目的通过观察不同剂量的CCK-8对吗啡依赖SH-SY5Y细胞模型内源性阿片系统的影响,初步探讨CCK-8与内源性阿片系统在吗啡依赖过程的相互作用及其机制。方法建立吗啡慢性依赖SH-SY5Y细胞模型,应用放射配基结合技术观察μ阿片受体(MOR)结合特征,应用Real-Time PCR技术检测前脑啡肽原(PENK)、前阿黑皮质素原(POMC)基因的表达,并观察CCK-8对上述指标的影响。结果①10μmol·L-1吗啡作用于全反式维甲酸(RA)分化6d的SH-SY5Y细胞48h,成功建立了慢性吗啡依赖模型;②CCK-8可剂量依赖性地抑制MOR的结合,并且此抑制作用可被CCK1及CCK2受体拮抗剂(L-364,718,LY-288,513)翻转;③10-7、10-6mol·L-1CCK-8使PENK、POMC的表达较正常组分别增加(5.81±0.84)、(7.26±1.55)倍和(4.55±0.73)、(5.16±0.82)倍。吗啡依赖后,PENK、POMC表达较正常组下降(0.43±0.10)倍和(0.37±0.07)倍,10-8、10-7、10-6mol·L-1CCK-8使下调的PENK、POMC表达增加,PENK与正常组的相对表达值为(0.63±0.10)、(0.86±0.21)、(1.17±0.19),POMC与正常组的相对表达值为(0.46±0.10)、(0.60±0.11)、(0.96±0.11)。10-10、10-9mol·L-1CCK-8对PENK、POMC表达无影响。结论低剂量(10-10、10-9mol·L-1)CCK-8可通过激活CCK受体抑制MOR的结合力,对PENK、POMC的表达无影响;高剂量(10-8～10-6mol·L-1)的CCK-8可使PENK、POMC基因表达增加,促进内源性阿片肽的生成,并可改善吗啡依赖后内源性阿片系统的失衡。

不同间隔时间电针对炎症痛大鼠下丘脑阿片肽基因表达的影响

目的：观察累加电针对炎症痛大鼠模型不同间隔时间的镇痛效果，从而探讨针刺镇痛的最佳治疗间隔时间。方法：96只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组和电针组，以佐剂性关节炎大鼠作为炎症痛模型。分别以3、6、12、24h作为电针治疗间隔时间。选用“昆仑”和“悬钟”穴，电针频率15～100Hz，疏密波，电压2～4V，留针20min。连续治疗6d后观测大鼠疼痛级别、痛阈、下丘脑前阿黑皮素和前脑啡肽原mRNA的表达。结果：电针组的疼痛级别明显低于模型组（P〈0．05），24h电针组的痛阈高于模型组（P〈0．01），各电针组下丘脑前阿黑皮素和前脑啡肽原mRNA表达的细胞数均明显高于模型组。在不同间隔时间电针治疗中，以间隔24h治疗更能明显降低炎症痛大鼠的疼痛级别并提高其痛阈，促进下丘脑前阿黑皮素和前脑啡肽原mRNA表达（P〈0．05或0．01）。结论：电针对炎症痛大鼠模型具有非常明显的镇痛作用，间隔24h重复治疗可显著提高其镇痛效果。

安君宁对吗啡依赖大鼠脑内前脑啡肽原表达的影响

目的研究安君宁对雄性SD大鼠吗啡依赖相关脑区前脑啡肽原表达的影响。方法30只体质量180～220g的雄性SD大鼠,设对照并建立吗啡依赖模型后随机均衡分为5组:淀粉正常对照组,吗啡戒断并安君宁治疗12d、30d组,吗啡戒断并淀粉治疗12d、30d组。吗啡依赖模型的建立采用剂量递增10日法(5mg·kg-1·次-1～50mg·kg-1·次-1,2次/d,腹腔注射)。安君宁干预方法:灌胃1g·kg-1·次-1,2次/d;对照组灌等量的淀粉。各组大鼠按预定时间麻醉、灌注、留取脑组织。采用原位杂交技术测定腹侧被盖区(VTA)、伏隔核(NAs)、前额皮质(PFC)前脑啡肽原(PENK)mRNA水平。结果安君宁干预组与干预对照组相比,VTA、NAs、PFC中PENKmRNA水平显著升高(P<0.05)。吗啡戒断12d,安君宁干预组VTA、NAs、PFC中PENKmRNA水平分别为(14.74±4.81)×10-2、(16.09±4.94)×10-2、(20.47±7.03)×10-2,而干预对照组分别为(9.74±0.87)×10-2、(5.94±0.91)×10-2、(10.87±3.96)×10-2;戒断30d,安君宁干预组分别为(17.46±8.27)×10-2、(25.73±8.24)×10-2、(26.58±6.29)×10-2,而干预对照组分别为(12.36±6.95)×10-2、(10.31±0.78)×10-2、(19.78±7.08)×102。结论安君宁能促进吗啡依赖大鼠依赖相关脑区前脑啡肽原表达的恢复。

一次给予红藻氨酸对大鼠脑内细胞信息传递通路及癫痫敏感性的作用

本实验给大鼠皮下注射红藻氨酸（ＫＡ，１０ｍｇ／ｋｇ）诱发癫痫活动，７２ｄ后进行深部前梨状皮层（ｄｅｅｐＰｒｅｐｙｒｉｆｏｒｍｃｏｒｔｅｘ，ＤＰＣ）电点燃刺激（ｋｉｎｄｌｉｎｓ），该组动物点燃形成加速，或再给予同样剂量ＫＡ，其再次诱发的癫痈活动明显加重。ｃ－Ｆｏｓ免疫反应活性（ｃ－Ｆｏｓ－ｉｒ）作为神经元兴奋的标志，标绘再次诱发癫痫活动时大鼠脑内细胞信息传递通路，并与对照组，即７２ｄ前给予生理盐水（Ｎ．Ｓ，１ｍｌ／ｋｇ）动物比较。结果表明，两组动物脑内细胞信息传递通路相同，实验组动物海马（ＨｉＰｐｏｃａｍｐｕｓ）内ｃ－ｆｏｓ，ｃ－ｊｕｎ基因表达呈非同步加速；海马邻近脑区内嗅皮层（ｅｎｔｏｒｈｉｎａｌｃｏｒｔｅｘ，Ｅｎｔ）激活加速，海马及Ｅｎｔ等部位前脑啡肽原（ｐｒｏｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ，ＰＥＮＫ）ｍＲＮＡ合成明显增加，提示一次给予ＫＡ诱发动物出现短暂癫痫活动后，可使该动物对癫痫刺激敏感性增强长期存在，这可能与脑内ｃ－ｆｏｓ，ｃ－ｊｎｎ表达非同步加速及快速启动前脑啡肽原基因表达有关。

海马内生长抑素及脑啡肽原mRNA对癫痫发作敏感性形成的影响

用惊厥剂量 ( 10mg/kg)的红藻氨酸 (Kainicacid ,KA)诱发SD大鼠出现癫痫发作后 ,观察癫痫发作对海马结构内、海马门部位含生长抑素 (SOM)的抑制性中间神经元以及海马齿状回颗粒细胞 (DGCs)部位的脑啡肽及脑啡肽原mRNA表达的影响。免疫组化结果显示 ,在癫痫发作敏感性形成期 (KA后 5～ 7d)出现前 ,海马门区含SOM抑制性中间神经元进行性脱失 ,而海马苔状纤维 (MF)部位的具有兴奋和致癫痫作用的ENK免疫反应阳性纤维明显增多 ;KA后 2d在海马的DGCs部位开始出现脑啡肽免疫反应阳性神经元。原位杂交技术显示 ,KA后海马DGCs部位脑啡肽原mRNA亦明显增加 ,其峰值出现在KA后 1d (P <0 0 1)。结果提示KA后海马结构内兴奋和抑制过程失衡 ,这很可能与KA后癫痫发作敏感性增强的形成有关。

饥饿胁迫24h对小鼠认知功能及海马区前脑啡肽原表达的影响

目的观察饥饿胁迫对小鼠认知功能和大脑海马区前脑啡肽原表达的影响。方法将40只小鼠随机分为对照组和饥饿24 h组(下称饥饿组),Morris水迷宫和八臂迷宫测试小鼠的认知功能。RT-PCR检测大脑海马区前脑啡肽原m RNA表达变化情况。结果饥饿组与对照组比较,1在Morris水迷宫测试中,饥饿组潜伏期明显缩短(P<0.05),通过原平台位置次数和穿越目标停留时间百分增加比(P<0.05);2在八臂迷宫测试中,饥饿组参考记忆错误和工作记忆错误减少(P<0.05);3在RT-PCR实验检测前脑啡肽原实验中,饥饿组小鼠大脑海马区前脑啡肽原表达明显降低(P<0.05)。结论 1饥饿胁迫可增强小鼠的认知功能;2饥饿胁迫通过降低小鼠大脑海马区前脑啡肽原来增强认知功能;3脑肠肽水平的调整可能是"脾藏意主思"功能实现的途径之一。

海马内脑啡肽原mRNA长期高表达可能与癫痫易感性长期存在有关

目的 :观察海马内脑啡肽原mRNA长期高表达与癫痫易感性的关系。方法 :用红藻氨酸癫痫模型制备癫痫发作动物 ,然后将其随机平均分为两组 ,每天分别给予生理盐水和中药蜈蚣粗提液 ( 16mg/kg)灌胃。 10d后再次给予同样剂量的KA检测癫痫发作易感性。结果 :KA后给予蜈蚣粗提液可明显抑制动物癫痫发作易感性。原位杂交结果显示 ,给予蜈蚣粗提液可防止KA后海马齿状回颗粒细胞中脑啡肽原mRNA的高表达。结论 :海马齿状回颗粒细胞中脑啡肽原基因的高表达很可能是癫痫发作易感性长期存在的重要原因之一。

电针刺激下即刻早期基因和前脑啡肽基因在中枢神经系统中的表达及定位研究

采用免疫组织化学、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交与原位杂交等方法，观察到２／１５Ｈ电针刺激可诱导大鼠中枢神经系统内即刻早期基因ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ的ｍＲＮＡ与免疫阳性物质以及前脑啡肽（ＰＥＮＫ）ｍＲＮＡ的生成。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交显示，电针在１～２ｈ内引起即刻早期基因ｃ－ｆｏｓｍＲＮＡ的表达，继之以ＰＥＮＫｍＲＮＡ的表达，在４８ｈ内方达顶点；形态学结果表明，电针诱导ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎ与ＰＥＮＫｍＲＮＡ及其蛋白产物的生成在中枢的分布具有明显的一致性。提示Ｆｏｓ／Ｊｕｎ可能作为ＰＥＮＫ基因的转录调节因子。