脂多糖体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4m RNA表达的影响

目的探讨时间和剂量对脂多糖（LPS）刺激小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4mRNA表达的影响。方法常规提取和培养小鼠腹腔巨噬细胞。时效实验,加入终浓度为1μg/ml LPS,分别刺激1,3,6,12 h后取材;量效实验,分别加入终浓度为0.00,0.01,0.1,1,10μg/ml LPS,3 h后取材。小鼠腹腔巨噬细胞TLR2/4 mRNA的表达采用RT-PCR进行。结果①在LPS 1μg/ml剂量下6 h内,随着时间的延长,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,与空白对照组相比有显著性差异（P〈0.05,P〈0.01）;但刺激时间达12 h时,细胞开始脱壁、死亡。②在LPS 0.01-1μg/ml剂量范围内,随着LPS浓度的增加,TLR2/4mRNA的表达量逐渐上升,呈一定剂量依赖关系,与空白对照组相比有显著性差异,（P〈0.05或P〈0.01）;但当LPS浓度达10μg/ml,TLR2/4 mRNA的表达量反而下降。结论用LPS体外刺激小鼠腹腔巨噬细胞,在0.01-1μg/ml浓度范围内,在1-6 h时间内,其TLR2/4 mRNA的表达呈现出一定的时效与量效关系,该研究可为今后的研究者提供有益的时间和剂量参考。

类固醇受体辅活化子-3蛋白在巨噬细胞炎症反应中的作用研究

目的探讨类固醇受体辅活化子（SRC）-3蛋白在脂多糖（LPS）诱导腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophages，PMφ）炎症反应中的作用。方法健康SPF级野生型（SRC-3＋/＋）小鼠、SRC-3基因敲除（SRC-3-/-）小鼠各5只，分别分离和原代培养PMφ，并分为SRC-3＋/＋组和SRC-3-/-组。收集并调整细胞浓度为1×10^6／mL，接种于6孔板，1mL／μL，给予10μg/mL LPS刺激，分别在刺激前（N）、刺激后4h和12h收集培养上清和PMφ。测定培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和NO的浓度，PMφ的p65、c—Jun和iNOS的表达及NF—κB和AP-1的DNA结合活性。结果PMO经10μg／mLLPS刺激4h和12h后，培养上清液中分泌的TNF-α、IL-1β、IL-6和NO均显著上升，但在相应时间点SRC-3-/-组显著低于SRC-3＋/＋组，当LPS刺激4h后，两组PMO培养上清液中HMGBl的表达水平与刺激前比较差异无统计学意义（P〉0．05），刺激12h后SRC-3＋/＋组有所升高，而SRC-3-/-组与刺激前比较差异无统计学意义（P〉0．05）；LPS刺激4h和12h后PMφ的p65和C—Jun表达显著增加，在相应时间点SRC-3-/-组的p65显著高于SRC-3＋/＋组，而SRC-3-/-组C—Jun却显著低于SRC-3＋/＋组；LPS刺激4h和12h后，SRC-3＋/＋组的iNOS表达逐渐增加，而SRC-3-/-组未见变化；LPS刺激4h和12h后NF—κB和AP-1的DNA结合活性均显著增高，在相应时间点SRC-3-/-组均显著低于SRC-3＋/＋组。结论SRC-3可能通过调节iNOS、NF—κB和AP-1的表达及活性来调控PMφ的炎症反应。

PGRN缺失型腹膜巨噬细胞对细菌脂多糖的体外炎症应答

目的观察颗粒蛋白前体(PGRN)对细菌脂多糖(LPS)诱导腹膜巨噬细胞(PM)炎症应答的影响。方法诱导提取野生型(WT)小鼠及PGRN基因敲除小鼠(KO)腹膜细胞(PEC),观察PEC数目、形态和类型;流式细胞术检测PEC的巨噬细胞表面标志物CD11b、F4/80。LPS分别处理WT或KO小鼠PM,LPS、重组PGRN或LPS加重组PGRN分别处理WT小鼠PM,培养24 h后收集细胞上清,ELISA法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素12(IL-12),Griess法检测一氧化氮(NO)。结果 PGRN缺失对小鼠PEC的数目、成分及巨噬细胞表面标志物CD11b、F4/80的表达无明显影响;与WT组相比,LPS诱导PGRN KO来源的PM分泌较高水平的TNF-α、IL-1β、IL-12及NO。外源给予重组PGRN后,LPS诱导WT组PM分泌TNF-α、IL-1β、IL-12及NO的水平降低。结论 PGRN缺失使PM对LPS的刺激产生了更强的炎症反应;外源性给予重组PGRN则可抑制LPS诱导PM释放前炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-12及炎症介质NO。