pEGFP-N1-TNFα表达载体的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1-TNFα重组质粒并鉴定,为转导CIK细胞并定位表达奠定基础。方法以pMD19Sim-ple T-TNFα为模板,PCR扩增TNFαCDS区片段,将PCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳,并回收TNFα条带,用BglⅡ和HindⅢ将TNFα的PCR片段及目的载体pEGFP-N1双酶切,然后进行连接。连接产物转化至DH5α中。挑取克隆,提质粒,进行鉴定。结果 PCR扩增片段、双酶切出现722bp大小的目的基因条带与预期结果相符;插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。结论成功构建了重组质粒pEGFP-N1-TNFα,为下一步用纳米材料转染CIK细胞的研究奠定了基础。

人类HLA-B7可诱导启动子调控IRES连接的人TNFα和IFNβ基因的重组逆转录病毒载体的构建

目的:为增强肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子表达,并调动免疫系统更有效地抑制和杀伤肿瘤细胞,构建在HLA-B7启动子调控下,IRES连接的人TNFα和IFNβ基因的重组逆转录病毒载体.方法与结果:将TNFαcDNA克隆人pBIuescript sk(+)中,改换酶切位点后定向克隆人含HLA-B7启动子的质粒中,构建成pGL3B7TNF.IFNβcDNA经定向插入pGEM-7Zf(+)改换酶切位点切下,定向克隆人含内部核糖体进入位点(IRES)的质粒中,构建成pIRE-SIFN.B7pro-TNFα和IRES-IFN β基因片段分别于各自载体酶切取出,再次插入中间载体,改换酶切位点后,先后定向插入pBlucscript sk(+)中,构建成pBLB7TNIRIF.用SacI+SalI+PvuI酶切回收B7pro-TNFα-IRES-IFNβDNA片段,补平后平端连入GINa逆转录病毒载体的BamH I补平位点,构建成重组逆转录病毒载体GINNaB7TNIRIF(+),结论:该载体的构建为调控各种肿瘤细胞MHCⅠ类分子增强表达,杀伤和抑制肿瘤研究奠定了基础.

TNF-α促进HepG2肝细胞脂质积聚及其机制的初步研究

目的探讨肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是否能够促进肝细胞脂质积聚,并对其机制进行初步探讨。方法将HepG2肝细胞分为空白对照组、单纯TNF-α组(TNF-α2ng/mL或20ng/mL)、软脂酸组(软脂酸0.08mmol/L或0.2mmol/L)及联合组(TNF-α2ng/mL联合软脂酸0.08mmol/L、TNF-α2ng/mL联合软脂酸0.2mmol/L、TNF-α20ng/mL联合软脂酸0.08mmol/L、TNF-α20ng/mL联合软脂酸0.2mmol/L),处理24h,应用化学酶促-比色法定量检测细胞内TG含量。进一步选取TNF-α20ng/mL和软脂酸0.08mmol/L,通过油红O染色观察HepG2细胞内脂质积聚情况;实时荧光定量PCR和Western blot检测HepG2细胞SREBP-1、FAS、ACCα的表达水平。结果①单纯TNF-α组TG含量[TNF-α2ng/mL组(0.344±0.093)μg/μg、TNF-α20ng/mL组(0.329±0.068)μg/μg]分别较空白对照组[(0.192±0.048)μg/μg]显著升高(P<0.05);联合组[TNF-α2ng/mL联合软脂酸0.08mmol/L组(0.451±0.096)μg/μg、TNF-α2ng/mL联合软脂酸0.2mmol/L组(0.821±0.257)μg/μg、TNF-α20ng/mL联合软脂酸0.08mmol/L组(1.032±0.286)μg/μg、TNF-α20ng/mL联合软脂酸0.2mmol/L组(2.134±1.049)μg/μg]分别较软脂酸组[软脂酸0.08mmol/L组(0.247±0.069)μg/μg、软脂酸0.2mmol/L组(0.341±0.031)μg/μg]显著升高(P<0.05);②油红O染色进一步显示,TNF-α促进肝细胞内脂质积聚。③实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示单纯TNF-α组与空白对照组相比,HepG2细胞SREBP-1、FAS、ACCα的表达均增加(P<0.05);联合组与软脂酸组相比,肝细胞内SREBP-1、FAS、ACCα的表达水平明显上调(P<0.05)。结论TNF-α促进HepG2肝细胞内脂质积聚,增加SREBP-1、FAS、ACCα的表达。

含P_RP_L，Ptac双启动子表达载体的构建

报道了一个新的含ＰＲＰＬ，Ｐｔａｃ双启动了的大肠杆菌表达载体ｐＮＪ的构建．在ＰＲＰＬ，Ｐｔａｃ分别或共同启动下，报告基因人肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）基因获得了较好的表达．双启动共同启动时的表达水平为两启动子分别启动时的表达水平之和．

人跨模型和跨膜稳定型肿瘤坏死因子-α的基因表达产物对体外培养的脑胶质瘤细胞的影响

为了探讨人跨膜型和跨膜稳定型肿瘤坏死因子 - α(TNF- α)对脑恶性胶质瘤基因治疗的有效方法 ,研究应用了基因重组、细胞培养以及免疫组化等技术 ,通过真核表达载体 pc DNA3转染 NIH3T3细胞 ,并在体外观察了 TNF- α对脑胶质瘤生长的影响。结果显示 :与对照组相比 ,TM- TNF- α组和 TM- TNF- αm组中 GFAP和 S- 10 0免疫反应阳性肿瘤细胞的数量、胞体截面积、周长、平均光密度皆明显减少。统计学分析提示差异有显著性意义。这表明 TNF- α基因的表达可明显抑制胶质细胞的生长和分化。而且 ,还发现跨膜稳定型 TNF- α的杀瘤效果较跨膜型 TNF- α强。这为 TNF- α基因用于胶质瘤的基因治疗提供了一定的实验依据 ,提示大剂量的 TNF- α在临床治疗可能产生毒副作用。