不同启动子驱动下马铃薯蛋白酶抑制剂PinⅡ转基因水稻的遗传、表达和对粘虫抗性分析

以不同启动子驱动的马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因(PinⅡ-2x,PinⅡ-4x)转基因水稻为材料,经潮霉素抗性、PCR和Southern blot等检测对转基因水稻后代进行了遗传分析。结果显示:外源基因在68.4%的转基因植株中符合孟德尔遗传模式,单拷贝植株率为63.6%。转基因植株后代的PinⅡ蛋白活性测定结果表明:ActI和Ubi驱动的PinⅡ-2x转基因水稻植株中,每克鲜叶片的PinⅡ蛋白含量为160μg和176μg,而由PIN5′驱动的PinⅡ-4x为104μg,对照水稻仅为20μg。ActI和Ubi驱动的PinⅡ表达产物对胰蛋白酶活性抑制程度分别达到37.7%和43.1%,明显高于PinⅡ自身启动子PIN5′(29.2%)。叶片饲养粘虫幼虫的实验表明:转基因植株叶片对粘虫有抗性,但抗性达不到显著水平,且启动子效率、PinⅡ表达量与抗粘虫性之间也没有相关性。

二倍体马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因的克隆、序列分析及表达载体的构建

根据GenBank发表的四倍体马铃薯栽培种(Solanum.tuberosum)来源的马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ基因序列,用PCR方法从二倍体马铃薯IVP101(Solanum.phurejia)cDNA文库和基因组DNA扩增得到马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ的cDNA和DNA,命名为PINⅡ2x。测序表明,PINⅡ2x基因组DNA全长580bp,含有一个115bp的内含子,cDNA有462bp(除去终止密码子)。推测的PINⅡ2x分子量是16.6kD,等电点6.08。与其他马铃薯蛋白抑制剂Ⅱ同源性比较表明,核苷酸同源性高达88%;推测的氨基酸序列同源性为93%,并具有相同的活性中心。RT PCR表明,PINⅡ2x的mRNA在叶片中具有强烈的伤害诱导表达特性。同时,构建了分别以水稻ActⅠ启动子和玉米Ubi启动子驱动PINⅡ2x基因的双元载体。

脑脉Ⅱ号胶囊对急性脑出血大鼠PAR-1动态表达的影响

目的:探讨急性脑出血后蛋白酶激活的受体(PAR-1)的动态表达及脑脉Ⅱ号胶囊(NMCⅡ)的干预作用。方法:将72只大鼠随机分为9组(n=8),即正常组、脑出血模型6,24 h,3,7 d组和NMCII 6,24 h,3,7 d组。用Ⅶ-S型胶原酶诱导大鼠脑出血模型。免疫组化方法测定各时间点大鼠脑出血后血肿周围水肿组织PAR-1蛋白的表达;RT-PCR检测PAR-1 mRNA的表达。结果:正常组大鼠脑出血后可见有PAR-1mRNA和PAR-1蛋白表达,模型组大鼠脑出血后6 h表达明显增多,24 h进一步增多,于3 d时达到高峰,7 d时表达明显减少。在6,24 h,3,7 d各时间点,模型组、NMCII组PAR-1 mRNA吸光度及PAR-1阳性细胞数升高,与正常组比较均有显著性差异(P<0.05或P<0.01),NMCII组PAR-1阳性细胞数、PAR-1 mRNA吸光度比值降低,与模型组比较各时间点均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。结论:脑出血后PAR-1受到凝血酶的持续活化,脑出血后凝血酶的作用可能是通过PAR-1介导的;NMCII可抑制PAR-1的表达,这可能是其治疗学机制之一。

真武汤对单侧输尿管梗阻模型大鼠整合素连接激酶和血管紧张素Ⅱ的干预研究

目的研究整合素连接激酶(ILK)和血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)在UUO大鼠模型的表达及真武汤对肾间质纤维化(RIF)的干预作用。方法采用单侧输尿管梗阻(UUO)方法复制大鼠肾间质纤维化模型,随机分为假手术组和造模组,造模组分为模型组、真武汤低剂量组、中剂量组、高剂量组和尿毒清对照组五组;分别给予相应药物灌服,术后2、3和4周分批取材,收集其尿液、血清,生化法检测24 h尿蛋白定量,ELISA法检测ILK和Ang-Ⅱ的蛋白表达。结果真武汤能够降低UUO大鼠模型血清中ILK和Ang-Ⅱ蛋白含量,具有统计学意义,真武汤中剂量组ILK和Ang-Ⅱ的含量蛋白最低。结论真武汤抑制了UUO大鼠模型血清中Ang-Ⅱ和ILK蛋白的表达,减缓了肾间质纤维化的发展和进程。

Preliminary Analysis of Proteases Associated With Photosystem Ⅱ Particles

The photosynthetic apparatus of plant is localised in chloroplasts. During the photosynthesis, the absorption, transfer and conversion, of light energy, water-splitting reaction and photophosphorylation take place in the chlorophyll-protein complexes of geometrically arranged pigments and proteins embedded in thylakoid membranes. The turnover of thylakoid membrane proteins requires various proteolytic activities. The Dl reaction center protein (Q_B-binding protein) has been demonstrated to require

无色杆菌蛋白酶Ⅰ肽链N端作用的突变研究

无色杆菌蛋白酶Ⅰ（AchromobacterproteaseⅠ，APⅠ）是高度专一于赖氨酸的丝氨酸蛋白酶．比较其它典型同类蛋白酶的一级结构，该酶的成熟体肽键在N端和C端分别长出9个和26个氨基酸践基．在其N端设计和构建了一些突变体，它们分别具有缩短或延长的N端．这些突变体低于天然酶的活性和稳定性的结果揭示，N端这部分延长在稳定该酶的活性构象方面起着重要作用．

无色杆菌蛋白酶Ⅰ突变体的结构与稳定性研究

报道了用定住诱变技术，改变无色杆菌蛋白酶Ⅰ的酶原加工位点，使其向左或向右移动，导致突变体成熟酶的肽链从N端延长或缩短若干氨基酸残基．所获突变体显示了低于野生酶的活性．突变体的园二色谱和荧光光谱研究表明，它们的结构发生了某些微小的改变．在不同的pH值、温度和不同浓度的SDS和盐酸胍条件下，也表现了低于天然酶的稳定性．在N端延长的突变体中，酶原加工位点越远离天然加工位点的突变体，显示了越低的活性和稳定性．缩短的突变体活性和稳定性最低．这些结果表明，天然成熟酶的N端可能比较靠近酶的活性中心，并参与构成活性中心附近的局部构象由此可见N端区在成熟酶的结构与功能方面的重要作用．

基于Cu(Ⅱ)离子的复合抑制剂可降低酶脱毛过程中胶原纤维的水解

酶脱毛过程存在成革松面、烂面的风险主要是由于脱毛过程中酶对皮胶原纤维的过度水解。实验采用加入复合抑制剂的方法以降低酶脱毛过程中酶对胶原过度水解,减少粒面伤害。探究了复合抑制剂对AS1.398酶水解活力的影响,筛选出基于Cu(Ⅱ)离子的复合抑制剂并应用于黄牛皮脱毛。实验结果表明:5 mmol/L Cu(Ⅱ)+20 mmol/L丁二酸钠复合抑制剂的加入,能保持酶脱毛速率且抑制脱毛过程中酶对胶原纤维的水解,粒面伤害少且毛孔结构完整。为安全高效的酶法脱毛工艺的工业化推广提供潜在的新策略。

与光系统Ⅱ颗粒结合的蛋白酶的进一步分析

依次用三种溶液抽提处理菠菜光系统Ⅱ颗粒，离心后分别得到主要含１８ｋＤ，２４ｋＤ和３３ｋＤ水溶性蛋白的三种抽提液，利用ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到前两种抽提液中均含蛋白酶．抽提液分别温育时，１８ｋＤ蛋白被降解而产生１７．１ｋＤ，１６ｋＤ，１４．４ｋＤ，１３．５ｋＤ和１２ｋＤ片段；２４ｋＤ蛋白被降解成２２ｋＤ，２０ｋＤ和１８ｋＤ．抑制剂实验表明。

Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶在非小细胞肺癌中的表达研究

目的研究Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶（typeⅡtransmembrane serine proteases，TTSPs）与非小细胞肺癌（NSCLC）发生发展的关系。方法利用基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO）的全外显子基因芯片数据，计算癌组织与癌旁组织的基因相对表达水平，筛选差异表达基因；研究肺癌组织中TTSPs基因的相对表达量，筛查NSCLC中特异性高表达的TTSPs，并分析其在不同分期肺癌中的表达差异；检测肺癌细胞株中TTSPsmRNA的表达。结果TMPRSS4、Malriptase、TMPRSS13在NSCLC中表达显著高于癌旁正常组织（P〈0．001）；TMPRSS4的表达在不同分期的肿瘤中差异有统计学意义（P〈0．05）；肺癌细胞株中检测到TMPRSs4、Matriptase、TMPRSS13的表达。结论TTSPs中的TMPRSS4、Matriptase和TMPRSS13：（ENSCLC中有特异性高表达，可能与肿瘤的发生发展相关。

基于碱性蛋白酶与铁(Ⅱ)盐的还原染料上染棉织物

比较研究了碱性蛋白酶和连二亚硫酸钠还原体系的不同染料上染棉织物,结果表明,大多数情况下,二者染浴效果和K/S值(表征染色强度)基本相当。个别染料在碱性蛋白酶体系中的染色强度比在连二亚硫酸钠体系中的染色强度更好,而另一些染料则相反。有染料和无染料两种情况下,连二亚硫酸钠体系还原浴仅稳定存在1 h,而碱性蛋白酶体系还原浴能稳定存在24 h。连二亚硫酸钠体系还原染色棉织物的色牢度很好。配制碱性蛋白酶与铁(Ⅱ)盐还原浴,可获得几乎与之相同的染浴特性,即棉织物的染色强度高,色牢度好。

利用基因表达谱芯片研究东方田鼠和小鼠感染日本血吸虫前后基因的差异性表达

利用大、小鼠基因表达谱芯片分别研究了Balb c小鼠感染日本血吸虫 7d时肺组织、东方田鼠感染日本血吸虫 7d时肺组织、1 2d时的肺和肝组织基因差异表达方式。结果表明 ,小鼠感染日本血吸虫 7d时肺丝氨酸蛋白酶抑制剂 (Serineproteaseinhibitor)基因表达上调 ,同时没有免疫相关基因的表达变化 ;与之相反 ,东方田鼠感染日本血吸虫 7d时肺丝氨酸蛋白酶抑制剂基因没有表达变化 ,非特异性免疫相关基因 ,如溶菌酶 (Lysozyme)和各类组织蛋白酶 (Cathepsin)基因表达上调 ,而且肺内特异性免疫相关基因如CD74、MHCⅡ和MHCⅠ等表达上调。这一现象得到东方田鼠感染日本血吸虫 1 2d时肺和肝中特异性免疫和非特异性免疫相关基因的上调表达的进一步证实。而且 ,东方田鼠感染日本血吸虫 1 2d时肺中丝氨酸蛋白酶抑制剂基因表达下调 ,肝组织中胰岛素样生长因子 1 (Insulin likegrowthfactor 1 ,IGF 1 )基因表达下调。提示日本血吸虫适宜性宿主小鼠和非适宜性宿主东方田鼠感染日本血吸虫前后两者有相反的基因表达方式。

生姜蛋白酶提取及反胶束纯化工艺初步研究

本文研究了生姜中生姜蛋白酶的分布及贮藏中的活力变化 ,研究了从新鲜生姜中提取生姜粗蛋白酶及用AOT 异辛烷和CTAB庚烷 /辛醇反胶束萃取该酶的工艺和方法。实验结果指出 :在贮藏茎中生姜蛋白酶的活力为 2 .7μg/mL·min-1,在膨大茎中该酶活力为 0 .6 8μg/mL·min-1,而在幼嫩茎中活力最低 ,仅为0 .4 8μg/mL·min-1。新鲜生姜在 0℃下贮藏 2 4h即完全丧失活力 ,在室温下贮藏 3d后其活力损失达38 2 5 %。用 10倍 0 .2mol/L、pH =6 .0的磷酸缓冲液 (4℃ )三次提取生姜蛋白酶 ,其提取率分别为 6 4 .75 %、14 .2 8%和 5 .2 %。用 6 5 %饱和度的 (NH4) 2 SO4沉淀提取液中的生姜蛋白酶 ,再以 pH 6 .2、0 .1mol/L的柠檬酸缓冲液溶解 ,其比活力达到 4 .2 1(μgPro/ μgPro·min-1)。生姜蛋白酶的 pI =5 .4～ 5 .5 ,在pH 5 .4以上 ,用AOT 异辛烷反胶束不能萃取出生姜蛋白酶 ,但却可以萃取出 71.86 %的杂蛋白。用CTAB庚烷 /辛醇反胶束二次萃取AOT 异辛烷萃余液 ,其蛋白质萃取率为 6 0 .2 5 % ,萃取液中生姜蛋白酶理论比活力达到 4 9.77(μgPro/ μgPro·min-1)。

跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS3与遗传性耳聋

跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS3(transmembrane protease,serine3)属于TTSPs(typeⅡtransmembrane serine proteases)家族成员,在分子结构上,TMPRSS3具有典型的TTSPs结构域,如丝氨酸蛋白酶、LDLRA、SRCR等.TMPRSS3有不同的蛋白异构体,其中异构体A是体内最主要的存在形式,主要在内耳表达,亚细胞水平定位于内质网膜上,TMPRSS3基因缺陷是遗传性耳聋DFNB8/10的遗传基础,因此目前对TMPRSS3的功能研究主要集中在听觉系统方面,此外蛋白异构体D还可能是卵巢癌的生物学标志物.TMPRSS3是迄今为止发现的第一个基因突变能引起耳聋的蛋白酶,表明听觉通路上的某些关键调控因子可能作为它的生理学底物被水解激活,从而介导相应的信号转导途径,但它激活了哪些信号通道,目前尚不清楚.借鉴mCAP(mouse channel activating protease)的功能预测ENaC(epithelial sodium channel)可能是TMPRSS3的作用底物,推测TMPRSS3参与内耳Na+平衡调控,但仍有待于体内实验证实.当前酶学领域研究技术的革新发展,尤其酶降解组学的应用,为认识蛋白酶TMPRSS3的功能及其复杂的分子调控机制提供了新的捷径.

酶法制备牦牛乳酪蛋白源血管紧张素转换酶抑制肽

应用6种商业蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白,研究其水解产物的血管紧张素转换酶抑制活性,结合蛋白水解度及蛋白回收率的结果,蛋白酶C适用于制备牦牛乳酪蛋白源血管紧张素转换酶抑制肽。

Matriptase在人类肿瘤中的作用

Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶Matriptase与多种实体肿瘤(如乳腺癌、前列腺癌、妇科肿瘤及头颈部鳞状细胞癌等)的发生、发展密切相关。Matriptase通过激活肝细胞生长因子前体、尿激酶前体、蛋白酶激活受体2等启动一系列蛋白酶级联反应,影响肿瘤细胞的生长和黏附,促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。此外,Matriptase与其同源性抑制剂肝细胞生长因子激活物抑制剂1比例失调后,也可导致肿瘤的发生。Matriptase在肿瘤发生、发展中的重要作用,使其有望成为肿瘤诊断的一个新指标,抑制Matriptase蛋白酶活性可能成为肿瘤治疗的新策略。

跨膜丝氨酸蛋白酶在人脑胶质瘤中的表达及其临床意义

Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSP)是一个相对较新发现的蛋白水解酶家族,并已成为癌症领域密切关注的热点。而跨膜丝氨酸蛋白酶3 (transmembrane protease serine 3,TM-PRSS3)作为TTSP中的重要一员,现已发现TMPRSS3蛋白不仅在人类多种恶性肿瘤中过表达,而且在肿瘤发生发展过程中发挥关键作用,特别是在转移侵袭性较高的肿瘤中,但其在人脑胶质瘤中的表达及作用机制目前尚未明确。

SPINK1在结直肠癌中的表达及其与预后的关系

目的探讨丝氨酸蛋白酶抑制剂KazalⅠ型(SPINK1)与表皮生长因子受体(EGFR)在结直肠癌中的表达及其与预后的关系。方法采用免疫组化法检测SPINK1、EGFR蛋白在结直肠腺瘤和结直肠癌患者中的表达情况,并分析二者的表达与临床病理特征及预后之间的关系。结果在结直肠癌中,SPINK1蛋白表达阳性率为78.18%(43/55),高于结直肠腺瘤20.93%(9/43,P<0.05)和正常对照组2.50%(1/40,P<0.05)。结直肠癌中EGFR蛋白表达阳性率为89.09%(49/55),高于结直肠腺瘤18.60%(8/43,P<0.05)和正常对照组7.50%(3/40,P<0.05)。结直肠癌SPINK1蛋白与性别、肿瘤大小、淋巴结有无转移、远处转移和肿瘤分期有关(P<0.05),EGFR蛋白与有无远处转移和肿瘤分期有关。Pearson相关分析显示SPINK1和EGFR在结直肠癌中表达呈正相关(r=0.496,P<0.05)。Kaplan-Meie分析显示SPINKl阳性表达的病例相对于阴性者具有较短的生存期或疾病进展期(P<0.05)。结论 SPINK1蛋白可能通过EGFR信号通路在肿瘤增殖与恶性转化发挥了重要作用。SPINK1可以作为判断结直肠癌预后的指标。

TMPRSS2重组蛋白阻断SARS-CoV-2假病毒的感染

为了探究Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶(type Ⅱ transmembrane serine protease,TMPRSS2)重组蛋白阻断严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)侵染宿主的能力,在体外构建假病毒感染细胞的体系,使用SARS-CoV-2 S(spike glycoprotein)蛋白携带水疱性口炎病毒(ΔG-VSV/荧光素酶)感染细胞,利用293F细胞体外纯化酶活及自身剪切位点突变的TMPRSS2重组蛋白,发现纯化的剪切位点R255Q和酶活位点S441A双突变的TMPRSS2重组蛋白,能够有效降低S蛋白与宿主细胞表面TMPRSS2的结合,进而阻断SARS-CoV-2假病毒对Calu3肺癌细胞系的感染。实验结果表明,使用突变的TMPRSS2重组蛋白竞争性结合病毒的刺突蛋白S,同抑制TMPRSS2蛋白酶的活性一样,都能阻断S蛋白的切割活化,抑制病毒与宿主细胞的膜融合,最终达到阻止病毒入侵的目的,这为阻断SARS-CoV-2感染提供了新的潜在靶点和思路。

降纤酶联合肝素钠治疗缺血性脑血管病50例的临床分析

目的：对降纤酶联合肝素钠治疗缺血性脑血管病进行临床分析。方法：观察组采用降纤酶联合肝素钠进行治疗，治疗过程中量测凝血酶原时间，没对照组进行观察。结果：观察组总有效率为94％，对照组分别为84％和67%，对比疗效有显著差异(P＜0．01)。起效时间对比：观察组5d内起效占58％，对照组分别为30％和23％，经统计学处理，差异非方显著(P＜0．01)。结论：降纤酶肝素钠联合治疗缺血性脑血管病，疗效显著，安全可靠，对在发病72h之内的急性缺血性脑血管病患者疗效尤住，对短暂性脑缺血发作疗效更佳。