Neural stem cell-conditioned medium upregulated the PCMT1 expression and inhibited the phosphorylation of MST1 in SHSY5Y cells induced by Aβ_(25-35)

A progressive neurodegenerative disease,Alzheimer’s disease(AD).Studies suggest that highly expressed protein isoaspartate methyltransferase 1(PCMT1)in brain tissue.In the current study,we explored the effects of neural stem cell-conditioned medium(NSC-CDM)on the PCMT1/MST1 pathway to alleviate Aβ_(25-35)-induced damage in SH-SY5Y cells.Our data suggested that Aβ_(25-35) markedly inhibited cell viability.NSC-CDM or Neural stem cell-complete medium(NSC-CPM)had a suppression effect on toxicity when treatment with Aβ_(25-35),with a greater effect observed with NSC-CDM.Aβ_(25-35)+NSC-CDM group exhibited an increase in PCMT1 expression.sh-PCMT1 markedly decreased cell proliferation and suppressed the protective role of NSC-CDM through the induction of apoptosis and improved p-MST1 expression.Overexpression of PCMT1 reversed the Aβ_(25-35)-induced decrease in cell proliferation and apoptosis.In summary,our findings suggest that NSC-CDM corrects the Aβ_(25-35)-induced damage to cells by improving PCMT1 expressions,which in turn reduces phosphorylation of MST1.

PRMT2及其剪接体在乳腺癌MCF-7细胞中的亚细胞定位及意义

目的构建蛋白质精氨酸甲基转移酶2(PRMT2)及其差异剪接体与绿色荧光蛋白(GFP)的真核表达载体,转染后观察其融合蛋白在乳腺癌MCF-7细胞中的表达及亚细胞定位,为进一步研究PRMT2基因及其新的差异剪接体在乳腺癌中的作用奠定基础。方法以p GEM-T-PRMT2/α/β/γ载体为模板,设计引物,PCR扩增目的基因,并将PCR产物克隆至pc DNA3.1/NT-GFP-topo载体,转化后将阳性克隆扩增,对PCR产物进行跑胶鉴定和测序。提取pc DNA3.1/NT-GFP-PRMT2/α/β/γ及空载体pc DNA3.1/NT-GFP质粒,用脂质体介导转染MCF-7细胞,在激光共聚焦显微镜下,观察外源性PRMT2/α/β/γ融合蛋白在MCF-7细胞中的亚细胞定位。采用Western blot法检测各重组融合蛋白在MCF-7细胞中的表达。结果各GFP在细胞中均有表达,但其在细胞中的分布位置不一致。PRMT2α与PRMT2γ的融合蛋白同PRMT2的分布一致,均聚集于核仁外的核浆,胞质中有少许分布;而PRMT2β和空载体的荧光蛋白的分布一致,都均匀分布于细胞的胞质和胞核,包括核仁部分。Western blot法检测表明各重组融合蛋白在MCF-7细胞中均有表达。结论PRMT2及其各剪接体的亚细胞定位不同,可能提示其在功能方面存在差异。

蛋白质精氨酸甲基转移酶1-非对称性二甲基精氨酸-二甲基精氨酸二甲胺水解酶1路径在肝纤维化、肾小管间质纤维化大鼠组织中的作用及意义

目的观察蛋白质精氨酸甲基转移酶1(PRMT1)-非对称性二甲基精氨酸(ADMA)-二甲基精氨酸二甲胺水解酶1(DDAH1)代谢轴在肝纤维化、肾小管间质纤维化大鼠模型体内的变化情况,并探讨血清ADMA水平与肝纤维化、肾小管间质纤维化程度间的相关性。方法 2015年9—12月,从40只SPF级Sprague-Dawley雄性大鼠中随机抽取20只,将其平均分为溶剂对照组(A组)和肝纤维化模型组(B组);再将剩余的20只SpragueDawley大鼠平均分为假手术组(C组)和模型组(D组),各10只。采用四氯化碳(CCl4)慢性染毒和单侧输尿管结扎的方法分别建立大鼠肝纤维化模型(B组)和肾小管间质纤维化模型(D组)。采用皮下注射等量花生油和单侧输尿管只分离不结扎的方法分别建立溶剂对照模型(A组)和假手术模型(C组)。A、B组大鼠分别于干预8周后,C、D组大鼠分别于干预2周后,采用Masson三色染色后计算肝、肾胶原纤维面积百分比;采用化学比色法检测肝、肾组织羟脯氨酸(Hyp)水平;采用改良的高效液相色谱法检测血清ADMA水平;采用蛋白质免疫印迹法检测肝、肾组织PRMT1、DDAH1表达水平。结果 A组、B组、C组、D组大鼠血清ADMA水平分别为(0.43±0.07)、(1.10±0.21)、(0.45±0.03)、(1.26±0.21)μmol/L。B组大鼠血清ADMA水平高于A组(t=6.32,P<0.05);D组血清ADMA水平高于C组(t=6.96,P<0.05)。血清ADMA水平与肝、肾胶原纤维面积百分比均呈正相关(r值分别为0.913、0.934,P<0.05)。血清ADMA水平与肝、肾组织Hyp水平均呈正相关(r值分别为0.856、0.878,P<0.05)。B组大鼠肝组织PRMT1表达水平高于A组,DDAH1表达水平低于A组(P<0.05)。D组大鼠肾组织PRMT1表达水平高于C组,DDAH1表达水平低于C组(P<0.05)。结论在肝纤维化、肾小管间质纤维化状态下,PRMT1-ADMA-DDAH1代谢轴中PRMT1表达增高,而DDAH1表达减低,可导致血清ADMA水平升高,引起肝血窦和肾小管周围毛细血管内皮细胞的损伤,从而参与纤维化进程的启动和病理改变的发生。

蛋白质精氨酸甲基转移酶2在乳腺癌细胞中的表达及其对SKBR-3细胞生长特性的影响

目的:探讨蛋白质精氨酸甲基转移酶2(protein arginine methyltransferase2,PRMT2)基因在多种乳腺癌细胞株中的表达情况,以及外源性PRMT2基因过表达对乳腺癌SKBR-3细胞生长特性的影响。方法:采用real-time RT-PCR法检测PRMT2基因在不同乳腺癌细胞株中的表达,并建立稳定表达pcDNA3.1/NT-GFP-PRMT2的SKBR-3细胞株;激光共聚焦显微镜下观察外源性PRMT2蛋白在细胞中的定位,检测在雌激素和雌激素受体(estrogen receptor,ER)拮抗剂4-OHT作用下过表达PRMT2基因对SKBR-3细胞增殖的影响。结果:PRMT2基因在ERα阳性乳腺癌细胞株中表达水平明显高于ERα阴性乳腺癌细胞株;在转染PRMT2基因的SKBR-3细胞株中,雌激素反应元件-荧光素酶报告基因(estrogen response elements-luciferasereporter,ERE-luc)的转录活性明显升高。在无处理因子情况下,外源基因PRMT2在SKBR-3细胞中的表达对细胞的形态及生长速度无明显影响。与未转染及转染GFP空载体的SKBR-3细胞相比,稳定转染PRMT2基因的SKBR-3细胞对雌激素的敏感性明显下降,但其对4-OHT处理的敏感性降低无明显差异。结论:PRMT2基因表达的多少及部位与乳腺癌细胞中ERα的表达密切相关。外源性PRMT2基因在乳腺癌SKBR-3细胞中稳定表达使细胞对雌激素的敏感性降低,但不增加细胞对ER拮抗剂4-OHT的耐药性。

蛋白精氨酸甲基化酶在小鼠外周神经损伤后背根神经节中的转录表达

目的探讨蛋白精氨酸甲基化酶(PRMT)在外周神经损伤背根神经节(DRG)转录表达与疼痛行为关系。方法构建C57BL6小鼠双侧L4脊神经结扎(SNL)外周神经损伤神经病理性疼痛模型,假手术Sham组作对照,收集SNL或Sham术后第7天DRG组织,行RNA-Seq测序全面分析PRMT家族9个基因在转录表达规律和组织分布情况,筛选出差异表达基因;建立小鼠单侧L4 SNL模型(Sham组作对照),测量各组在SNL术前(0 d)、术后3、7和14 d不同时点机械缩爪反应频率(PWF)和热缩爪反应潜伏期(PWL),收集两组上述不同时点患侧和对侧DRG行RT-qPCR验证差异基因表达情况;建立坐骨神经结扎慢性缩窄损伤(CCI)模型,假手术组Sham作对照,疼痛行为检测方法和时间点同SNL模型,RT-qPCR进一步验证CCI术后上述时点差异基因表达情况。结果(1)RNA-Seq测序结果表明,9个PRMT基因均表达与DRG内,其基础表达量最多的是Prmt2和Prmt3,最少的是Prmt6。与Sham组比较,SNL神经损伤上调DRG Carm1转录表达(增加1.7倍),抑制Prmt5、Prmt8和Prmt9这3个基因转录,其中Prmt8抑制最明显(下降16.3倍)。(2)RT-qPCR验证表明,与Sham组较,SNL外周神经损伤增加术后3、7和14 d PWF,降低PWL,上调DRG Carm1转录表达,而仅抑制Prmt8转录表达,Prmt1、Prmt5和Prmt9无明显改变。(3)同样的,CCI坐骨神经损伤亦增加CCI术后3、7和14 d PWF,降低PWL,上调DRG Carm1,抑制Prmt8在上述时点的表达。结论外周神经损伤致机械痛觉高敏和热痛觉过敏的同时,上调DRG Carm1转录表达,抑制Prmt8基因转录。

蛋白精氨酸甲基转移酶在E3大鼠哮喘模型中表达变化的研究

目的观察1～6型蛋白精氨酸甲基转移酶(PRMTs)在E3大鼠急性哮喘模型肺脏和脾脏中的表达变化。方法构建卵清蛋白诱导的E3大鼠急性哮喘模型,分为对照组和哮喘组,每组各10只大鼠,病理及生化检测评估模型构建情况,半定量PCR检测1～6型PRMTs的表达差异。结果和对照组相比,哮喘组大鼠肺脏组织中PRMT1(P<0.01)、PRMT2(P<0.01)、PRMT3(P<0.05)、PRMT5(P<0.05)的表达有显著性升高,而PRMT4(P<0.05)的表达显著性降低;哮喘组大鼠脾脏组织中PRMT2(P<0.05)、PRMT5(P<0.05)的表达也出现显著性升高。结论蛋白精氨酸甲基转移酶在E3大鼠急性哮喘模型肺脏和脾脏中有差异性表达,这可能在哮喘发病的基因转录后调节过程中发挥着重要的作用。

肽酰精氨酸的翻译后修饰

肽酰精氨酸残基甲基化作用是细胞质与细胞核内蛋白质翻译后修饰的普遍方式。精氨酸残基甲基化蛋白质与许多细胞生物学过程有关,包括转录调节、RNA代谢和DNA损伤修复等。生物体内精氨酸N-甲基转移酶类、肽酰精氨酸脱亚氨酶类与JMJD6等催化肽酰精氨酸残基进行甲基化、瓜氨酸化和去甲基化的动态修饰。这种动态修饰对细胞生物学功能有重要调节作用。

干扰PRMT5表达肝癌细胞稳转细胞株的建立及鉴定

目的探讨干扰蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)表达肝癌细胞稳转细胞株的建立及鉴定。方法针对PRMT5设计出该基因的有效短发夹RNA(shRNA)片段,选择合适慢病毒载体,通过基因工程技术,构建出PRMT5慢病毒载体介导的shRNA重组载体,并通过PCR以及测序检测构建序列的正确性。将重组病毒载体在病毒包装细胞中大量生产后,用病毒原液感染PRMT5表达量相对较高的SMMC-7721、BEL-7402细胞,2 d后,用最低杀死浓度的嘌呤霉素进行筛选,得到克隆样生长的细胞,扩大培养后分别提取蛋白和RNA,Western印迹和q PCR检测PRMT5的表达。结果成功构建出由人源性PRMT5慢病毒载体介导的shRNA重组载体p LKO.1-sh-PRMT5,PCR及测序均证明构建序列的正确。Western印迹法和q PCR检测,p LKO.1-sh-PRMT5干扰组的PRMT5蛋白及mRNA水平明显低于p LKO.1-sh-GFP组(P<0.05),p LKO.1-sh-PRMT5载体具有良好的干扰效果。结论运用慢病毒感染并筛选出稳转细胞株,在干扰效率及经济角度均优越于瞬时转染,为今后研究PRMT5在肝癌细胞中作用功能提供了良好的科研工具。

CARM1维持羊水干细胞干性的机制

背景:研究表明,CARM1催化的组蛋白H3R17/R26的甲基化修饰对于胚胎干细胞干性的维持起着非常重要的作用,但其在羊水干细胞干性维持中的作用及机制目前尚不明确。目的:初步探讨CARM1在维持羊水干细胞干性中的作用及其分子机制。方法:分离、培养人妊娠晚期羊水干细胞,RT-PCR鉴定干细胞标志物及CARM1基因的表达。利用CARM1的两条shR NA慢病毒表达载体,沉默羊水干细胞中CARM1基因的表达。RT-qP CR检测CARM1基因的表达沉默效率,Western blot检测组蛋白H3R17的甲基化水平。RT-qP CR检测干细胞标志物OCT4,SOX2和NANOG基因的表达水平。结果与结论:(1)人妊娠晚期羊水干细胞能够表达干细胞标志物,包括OCT4、SOX2、Nanog和KLF4,并表达CARM1基因;(2)CARM1的两条shR NA均能够有效沉默CARM1基因的表达;(3)CARM1表达沉默后,羊水干细胞中组蛋白H3R17的甲基化水平降低,OCT4和SOX2的表达也降低,而NANOG的表达没有发生变化;(4)结果表明,CARM1可能通过调控OCT4和SOX2基因的表达,进而起到维持羊水干细胞干性的作用。

靶向PRMT2基因的micro RNA对雌激素介导的乳腺癌MCF7细胞增殖的影响

目的:构建靶向人蛋白质精氨酸甲基转移酶 2 (protein arginine methyltransferase2,PRMT2)基因的microRNA真核表达载体,鉴定其稳定转染乳腺癌细胞株MCF7后对细胞增殖的影响。方法:根据PRMT2mRNA序列设计合成pre-microRNA片段,定向克隆至pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体,并稳定转染入MCF7细胞。采用间接免疫荧光法和蛋白质印迹法检测重组体对PRMT2表达的干扰效果以确定其生物活性。采用结晶紫实验和平板克隆形成实验检测重组体转染对MCF7细胞体外增殖和细胞克隆形成能力的影响。FCM法检测重组体转染对MCF7细胞周期的影响。结果:构建的重组体插入片段的碱基序列完全正确,并且重组体稳定转染MCF7细胞后可成功干扰PRMT2基因的表达。在无处理因子的情况下,重组体转染对细胞的生长速度无明显影响;与转染空载体的MCF7细胞相比,稳定转染重组体的MCF7细胞对雌激素的敏感性增强,但其对雌激素拮抗剂4-OHT处理的敏感性无明显差异。平板克隆形成实验表明,重组体能够增强雌激素介导的MCF7细胞的克隆形成能力。FCM法检测表明,转染重组体的MCF7细胞中G2期细胞比例明显升高(P<0.05)。结论:成功构建靶向PRMT2基因的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR真核表达载体,且在稳定转染MCF7细胞后具有生物学活性。抑制内源性PRMT2基因的表达能够提高雌激素介导的MCF7细胞的增殖和克隆形成能力,上调雌激素受体α目标基因cyclinD1和c-myc的表达,促进细胞周期进程。

菜薹蛋白精氨酸甲基转移酶基因BrcuPRMT5的克隆及表达分析

以‘油青49’和‘油青甜菜薹80’菜薹茎尖为材料,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得组蛋白甲基转移酶基因Brcu PRMT5的全长cDNA和gDNA序列。BrcuPRMT5 cDNA序列全长为2 117 bp,其中完整开放阅读框为1 929 bp,编码642个氨基酸,相对分子量为71.55 kD,理论等电点(p I)为5.87;多序列比对结果表明,Brcu PRMT5编码的氨基酸序列含有高等植物PRMT5基因1个高度保守的结构域;系统发育分析结果显示与大白菜、油菜及甘蓝的亲缘关系最近;亚细胞定位软件分析得知,Brcu PRMT5蛋白无跨膜区域,可能定位于线粒体中;对应的gDNA全长为4 151 bp,含有23个外显子和22个内含子,最长的外显子长度为140 bp,内含子的长度范围为50~150 bp。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术分析基因的表达,BrcuPRMT5在菜薹不同组织中均有表达,其中在花中表达量最高,叶次之,根中最低;BrcuPRMT5从苗期至完全抽薹开花期的表达量呈现上升趋势。BrcuPRMT5在菜薹花发育过程中可能起一定的调控作用。

慢性阻塞性肺疾病小鼠模型肺组织中PRMT6的表达及其与炎症基因表达的关系

目的探讨采用腹腔注射吸烟提取物（CSE）构建的慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型肺组织中蛋白精氨酸甲基转移酶6（PMRT6）的表达及其与IL-6和COX-2基因表达的关系。方法16只雄性6周龄近交无特定病原体（SPF）级C57BL／8J小鼠随机分为正常对照组（8只）和COPD组（8只），采用经腹腔注射CSE方法建立小鼠COPD模型。检测小鼠肺功能并收集两组小鼠肺组织，HE染色检测小鼠肺组织病理改变，Westernblotting检测两组小鼠肺组织中PRMT6蛋白表达情况及组蛋白H3R2进行非对称双甲基化（H3R2me2a）和H3K4的三甲基化（H3K4me3）信号水平，qRT—PCR检测小鼠肺组织中PMRqq5及IL-6、COX-2的mRNA表达情况。结果与对照组比较，COPD模型小鼠肺组织呈现典型肺气肿改变，肺功能显著下降，并且肺组织中PRMT6的mRNA及蛋白表达显著下降，组蛋白H3R2me2a信号水平下调，而H3K4me3信号水平上调，同时IL-6和COX-2的mR．NA表达均增高，PRMT6与IL-6、COX-2的mRNA表达呈负相关。结论CSE诱导的COPD小鼠模型中PRMT6明显下调，抑制组蛋白H3R2二甲基化并促进H3K4三甲基化，PRMT6与IL-6和COX-2炎症基因转录表达呈负相关，PRMT6可能通过调控组蛋白甲基化水平激活炎症基因的转录表达参与COPD的发生。