耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a转肽酶区的克隆表达及纯化鉴定

目的:对编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)青霉素结合蛋白2a(PBP2a)转肽酶区的mecA基因片段进行克隆、表达、纯化及鉴定。方法:根据基因文库登录的mecA基因的编码序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,应用PCR技术从MRSA基因组DNA中扩增获得编码PBP2a转肽酶区的DNA片段,将此目的基因片段克隆至pET-His载体,经酶切鉴定、测序正确后,转化E.coliBL21(DE3)plysS;用IPTG进行诱导表达后,利用Ni2+亲和层析技术从表达蛋白中纯化目的蛋白;对表达的蛋白以MRSA胶乳凝集试剂盒进行鉴定。结果:成功构建了PBP2a转肽酶区原核表达载体,并获得了高效表达,制备了高纯度的目的蛋白。结论:获得了高纯度的PBP2a转肽酶区蛋白,为其进一步研究奠定了基础。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a转肽酶区的克隆、表达及纯化鉴定

目的构建编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)青霉素结合蛋白2a(PBP2a)转肽酶区基因片段的原核表达载体,并表达、纯化及鉴定蛋白。方法从临床标本中分离鉴定MRSA,设计针对编码PBP2a转肽酶区基因片段的引物,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,克隆至pET28a(+)载体,双酶切鉴定并测序,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS株;用0.7mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,利用Ni亲和层析技术纯化目的蛋白;蛋白免疫印迹法(WB)鉴定重组蛋白。结果重组表达载体经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切,产物在预期大小处出现条带,测序结果显示有两个碱基突变,无移码突变。所表达的PBP2a蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和WB鉴定,在相对分子质量38×103处可见一新生蛋白条带。结论成功构建了PBP2a转肽酶区原核表达载体,并获得了高效表达,制备了高纯度的目的蛋白。

以可溶性PBP2a为靶点筛选拮抗MRSA中药的实验研究

目的以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)临床分离株青霉素结合蛋白2a(PBP2a)的可溶性片段为靶点,利用生物传感器筛选能够拮抗MRSA的中药。方法从临床上分离鉴定出MRSA,利用基因重组技术体外诱导表达PBP2a25～668位氨基酸,并对表达的可溶性蛋白进行鉴定及生物学功能分析;然后将PBP2a包被于羧甲基葡聚糖样品池上,利用生物传感器筛选能够拮抗MRSA的中药。结果成功诱导表达出可溶性目的蛋白PBP2a,相对分子质量为74×103,且具有一定的转肽酶及β-内酰胺酶活性;利用生物传感器筛选出10种能够拮抗MRSA的中药,其中黄芩、黄连、夏枯草3种中药抗MRSA作用较强。结论以MRSA临床分离株中可溶性PBP2a为靶点,利用生物传感器成功筛选出了能够拮抗MRSA的中药。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a 382～443片段的原核表达及鉴定

目的对编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）及青霉素结合蛋白2a（PBP2a）382～443位氨基酸的mecA基因片段进行克隆、表达及鉴定。方法根据基因文库登录的mecA基因的编码序列，针对编码PBP2a382～443位氨基酸的mecA基因片段，设计合成4条寡核苷酸片段，再将4条片段人工拼接成目的基因片段，然后克隆至PET-His载体，经酶切鉴定、测序正确后，转化E.coli BL21（DE3）plysS，用IPTG进行诱导表达，并对表达的蛋白以MRSA胶乳凝集试剂盒进行鉴定。结果构建了相应的PET-His克隆，经诱导表达和鉴定，证实成功表达出目的蛋白。结论成功表达出PBP2a382～443片段，为其进一步的纯化和应用奠定了基础。

野生型金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆与分析

根据A、B、C和D肠毒素基因的序列设计特异引物,采用聚合酶链式反应(PCR)方法对食品中的金黄色葡萄球菌进行检测和鉴定肠毒素基因型,并进一步克隆肠毒素基因。结果表明,待检食品中的金黄色葡萄球菌的肠毒素基因为A型,序列长为774bp,编码257个氨基酸残基,同其他肠毒素A高度相似,等电点为8.85,是一种膜结合蛋白,功能结构域和三位结构预测分析发现此蛋白含有肠毒素家族结构域和肠毒素C家族结构域。

金黄色葡萄球菌eap基因的克隆与表达

目的构建携带eap基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组EAP融合蛋白。方法PCR法扩增金黄色葡萄球菌基因组DNA,回收、纯化的扩增产物与pMD18-T载体相连接得重组质粒pMD18-T-EAP,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;未酶切组作为对照组重组质粒pMD18-T-EAP和pET28a(+)表达载体分别用NdeI和XhoI限制性内切酶双酶切、连接,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;空载体作为对照组。用不同浓度(终浓度1、2、4、8mmol/L)和不同诱导时间(1、2、3、4、5、6h)的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对阳性重组菌进行表达优化,分别取E.coli上清液和沉淀做电泳分析。应用MagneHis-蛋白纯化系统纯化重组EAP融合蛋白,并通过薄层扫描测定蛋白质的浓度。结果所获eap基因与GeneBank的基因序列同源性>99%;氨基酸同源性达100%。重组质粒经IPTG诱导,阳性重组菌转化子均有表达;当吸光度(A)值等于0.6～0.8时,相对分子质量约70000处出现目的蛋白条带。破碎的重组菌pET28a-EAP上清液中目的蛋白条带较清楚,沉淀中几乎看不到。终浓度1mmol/L为最佳蛋白表达工作浓度。IPTG诱导1h重组EAP融合蛋白有一定量的表达,随着时间的延长,表达量增加不明显,3h时的表达量达最高,之后,蛋白表达量变化不明显。表达的重组EAP融合蛋白含量占全菌体蛋白的29.6%。结论成功地克隆和表达了金黄色葡萄球菌重组EAP融合蛋白,为进一步研究以EAP蛋白作为免疫原预防和治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病奠定基础。

牛IgG Fc片段与FnBPB-ClfA串联表达及其对金黄色葡萄菌性奶牛乳腺炎的免疫效果

为了提高金黄色葡萄球菌(S.aureus)黏附素FnBPB-ClfA基因表达蛋白对奶牛的免疫效力,应用RT-PCR扩增奶牛IgG Fc基因片段与构建的金黄色葡萄球菌(S.aureus)FnBPB-ClfA黏附素基因串联构建质粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA,并通过双酶切将其克隆于pET32a(+),以构建质粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA并进行诱导表达。以盐酸左旋咪唑(LH)或氢氧化铝(ALUM)为佐剂,与纯化的重组蛋白(bFcFnBPB-ClfA)混合以首次免疫肌肉注射,加强免疫乳头管灌注或首次免疫、二次免疫及三次免疫均以肌肉注射方式免疫临近干奶期的奶牛。用间接ELISA和Western blot对各组牛血清中的抗体进行监测,评价免疫效果。结果显示,以LH为佐剂免疫的(A组)牛21d时抗体水平最高,可达到1∶1 600;而以ALUM为佐剂免疫的B组和C组抗体水平分别为1∶800和1∶400。IgG水平动态监测结果表明,以LH为佐剂免疫牛的血清中特异性抗体上升趋势明显高于其他免疫组。研究结果表明,以首次免疫肌肉注射,加强免疫乳头管灌注的方式较好,并且bFc-FnBPB-ClfA与LH佐剂混合后免疫奶牛能最有效激发奶牛免疫反应。

中国7所教学医院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子流行病学及耐药性研究

目的调查2007年中国7所教学医院耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的分子流行病学分布及耐药性特征。方法采用多位点序列分型(MLST)和葡萄球菌蛋白A基因(spa)分型技术对114株MRSA进行分子流行病学研究,并进行Panton-Valentine毒素(PVL)编码基因lukS检测,采用琼脂稀释法进行13种抗菌药物的药敏试验。结果 114株MRSA中共发现8种MLST-spa分子克隆型,ST239-t030、ST239-t037和ST5-t002是主要的型别,分别占总数的41.2%、28.8%和21.9%。仅有1株MRSA检测到lukS基因阳性。MRSA菌株最敏感的抗菌药物为万古霉素与替考拉宁(100%),甲氧苄啶-磺胺甲口恶唑次之(86.8%);主要的分子克隆型ST239-t030、ST239-t037和ST5-t002菌株具有相似的药敏谱,但所有甲氧苄啶-磺胺甲口恶唑耐药菌株均属于ST239-t037。结论在中国MRSA的流行株由数种主要的分子克隆型引起,与周边国家和地区的情况基本一致。

金黄色葡萄球菌蛋白质相互作用网络及功能

【目的】金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性菌,是目前最难以对付的病菌之一。它能引起多种感染,特别是在医院环境中。近年来,抗药性金黄色葡萄球菌传染更加严重,已成为公共卫生威胁。由于以前对于金黄色葡萄球菌的实验性研究大都是基于单个基因或者蛋白进行的,为了更好的研究这个物种,有必要从整体上把握金黄色葡萄球菌的蛋白作用机理。【方法】采用系统发生谱、操纵子法、基因融合法、基因邻近法、同源映射法等5种计算方法预测金黄色葡萄球菌蛋白质相互作用网络。【结果】从蛋白组的角度构建了金黄色葡萄球菌蛋白相互作用网络,并对网络进行功能分析。【结论】网络的分析表明金黄色葡萄球菌的蛋白质相互作用网络也服从scale-free属性,发现了SA0939、SA0868、rplD等重要的蛋白。通过对金黄色葡萄球菌的重要的细胞壁合成和信号转导调控蛋白局部网络分析,发现了一些对这两个系统十分重要的蛋白分子,这些信息将为更好的了解金黄色葡萄球菌的致病机理和开发新的药物靶点提供指导。

金黄色葡萄球菌表面蛋白SdrD的原核表达及抗体制备

根据金黄色葡萄球菌表面蛋白SdrD基因序列设计特异性引物,以金黄色葡萄球菌标准菌株基因组为模板进行PCR扩增,获得了大小为2 043bp的基因片段。将基因片段连接至表达载体pET26b,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果表明,SdrD基因获得了较好的表达,重组蛋白的分子质量约为99ku。利用免疫亲和层析对目标蛋白进行纯化,获得了纯度较高的目标蛋白。用该蛋白免疫新西兰白兔制备了多克隆抗体,抗体效价达到1∶23 000,为金黄色葡萄球菌基因工程疫苗的开发与性能评价,以及该致病菌免疫检测技术的开发奠定了基础。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因多态性分型研究

目的探索一种准确、快速、可靠的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的分子生物学分型方法,了解医院内MRSA的多态性,为临床合理、有效地使用抗生素和控制耐药基因在种群间的传播提供帮助。方法用MecA基因相关高变区PCR扩增(HVR-PCR)和随机扩增多态性DNA(RAPD)两种方法,对MRSA菌株进行多态性分析。HVR-PCR检测MecA基因相关高变区正相重复序列元件(DRUs)的长度,根据DRUs数目的不同对MRSA分型;RAPD根据电泳图谱中条带的数目及位置,经NTSYS统计软件进行聚类分析,得到遗传树状图,按MRSA菌株之间的相关性进行分型。结果应用HVR-PCR方法可将31株MRSA标本分为7型,分别含有7、8、9、10、11、12和16个DRUs,其中10DRUs型最多[11/31(35.48%)],16DRUs型最少[1/31(3.23%)];应用RAPD分型,31株MRSA共分10型,其中以Ⅳ型为主[10/31(32.26%)],其他型分布比较接近。在11株HVR-PCR分型的10DRUs型中RAPDⅣ型4株[4/11(36.36%)],RAPDⅢ型和RAPDⅣ型各2株[2/11(18.18%)];10株RAPDⅣ型中9DRUs型、10DRUs型各4株[4/10(40.00%)]。结论 RAPD方法和HVR-PCR方法对MRSA的分型率都比较高,而且这两种方法都比较简单、稳定、可靠、快速,实用性强,具有广阔的应用前景。

金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因femB的克隆和原核表达

金黄色葡萄球菌femB基因与甲氧西林高水平耐药密切相关,可能成为开发抗MRSA药物的新靶位.以金葡菌基因组DNA为模板,PCR扩增femB全长基因,所得片段与pGM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆以PCR、双酶切及测序鉴定.将鉴定正确的目的片段定向克隆到pGEX-4T-1表达载体中,转化至大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达GST/FemB融合蛋白;采用SDS-PAGE及Western blot对融合蛋白进行鉴定.结果显示,重组质粒在宿主菌中获得了高效表达,融合蛋白相对分子质量为75 kD,该融合蛋白可与抗GST-tag抗体特异结合;表明femB基因的原核表达系统构建成功,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.

金黄色葡萄球菌IsdD基因的克隆与表达

金黄色葡萄球菌是一种重要的人畜致病菌,IsdD属于金黄色葡萄球菌Isd系统中的重要成员。本研究根据Gen-Bank报道的金黄色葡萄球菌IsdD基因序列设计一对特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板扩增出目的片段Is-dD,将其用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到载体pET32a(+)上,构建重组质粒pET32a(+-)IsdD。序列分析结果显示,目的基因序列与网上的IsdD序列相比核苷酸序列和氨基酸序列同源性均在98%以上。将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21中并成功诱导表达出大小为61.3ku的蛋白,这为下一步研究IsdD蛋白的结构和功能奠定了良好基础。

介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP功能肽段在E.coli中的可溶性表达及功能

目的:将介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP的重要功能肽段与GST蛋白在大肠杆菌中融合表达.方法:利用合成的特异性引物钓取金黄色葡萄球菌基因组中的目的片段,将其克隆入pGEX-KG载体,在大肠杆菌中与GST蛋白进行融合表达.结果:成功地表达了目的肽,可溶性的表达产物占细菌可溶性蛋白的20%左右,且目的肽与配基纤连蛋白Fn具有结合的能力.结论:成功地表达了介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP中的重要功能肽段,为研究金葡菌侵袭细胞的机制奠定了基础.

可控细胞膜孔形成蛋白基因的克隆与表达

根据Wood 4 6株金黄色葡萄球菌α溶血素 (α HL)基因序列设计了引物 ,用高保真PCR从 180 0株金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出了 0 .9kb的α HL基因 ,序列测定结果显示 ,两菌株α HL基因的核苷酸序列有 6个碱基差异 ,但仅引起 1个氨基酸替换。用PCR分段克隆和定点突变技术将大肠埃希氏菌外膜蛋白A信号肽序列与α HL编码区融合 ,并将其第 130～ 134位氨基酸替换为 5个连续的组氨酸 ,获得的融合基因命名为H5基因。将其克隆入 pET 30a质粒 ,用获得的重组质粒pET H5转化感受态大肠埃希氏菌 ,获得分泌性表达H5的重组菌。经IPTG诱导后 ,重组菌表达出分子质量为 35ku的H5蛋白。经镍柱亲和层析纯化的H5对兔红细胞的半数溶血值为 180ng/mL ,能使鼠成纤维细胞PA317获得对台盼蓝和海藻糖的通透性 ,且能被Zn2 + 抑制。提示 ,表达的H5蛋白为可控细胞膜孔形成蛋白 。

食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因及其表达检测

金黄色葡萄球菌作为一种常见人类病原菌,可通过各种途径污染食品,引发食物中毒。其中,金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)的分泌会大大增加其侵袭性和致病力。通过对比肠毒素基因的携带及其表达情况,有助于进一步分析肠毒素表达的环境条件,为产肠毒素金黄色葡萄球菌的防范和控制提供理论和数据支持。本研究采用PCR和3M^TMTecra^TM微孔板法分别检测33株食源性金黄色葡萄球菌中5种传统肠毒素SEA^SEE基因的携带及表达情况,结果显示,该批金黄色葡萄球菌中SE基因的检出率为100%,携带率最高和最低的分别为seb(48.48%,16/33)和see(9.09%,3/33)。而其中SE蛋白得到表达的菌株仅为63.64%(21/33),这表明不是有SE基因携带就一定可以有相应毒素蛋白的表达,可能还需相应的系统调控和适宜的环境因素。

德江天麻蛋白对金黄色葡萄球菌的抑制作用研究

为了探讨天麻蛋白对金黄色葡萄球菌(金葡菌)的抑制作用,本研究以德江天麻为原料,提取天麻蛋白,检测天麻蛋白在不同浓度和不同时间条件下对金葡菌抑菌率的影响.利用实时荧光定量PCR检测金葡菌的毒力基因的表达变化,用试剂盒检测天麻蛋白对金葡菌细胞外碱性磷酸酶含量的影响和总肠毒素表达量的影响,用细菌计数法检测天麻蛋白对感染金葡菌小鼠死亡保护率和肺部细菌数量的影响.结果显示,天麻蛋白分子量分布于25~35 kDa,其对金葡菌的抑菌率呈现出剂量依赖性,天麻蛋白的抑菌率随着与金葡菌作用时间的延长而增加;天麻蛋白可抑制金葡菌毒力基因sea,agrA,hla及总肠毒素的表达,又可增加金葡菌细胞外碱性磷酸酶含量,并且均具有浓度依赖性;天麻蛋白降低了金葡菌肺炎小鼠死亡率,减少了小鼠肺脏中金葡菌的定植数量.以上结果说明,天麻蛋白在宿主体内外均可抑制金葡菌的生长.

猪圆环病毒2型ORF2单克隆抗体的制备与鉴定

以杆状病毒表达系统表达PCV2ORF2重组蛋白为免疫原,旨在获得针对PCV2的特异性单克隆抗体。用Sf9细胞表达PCV2ORF2重组蛋白,通过层析柱和超滤管浓缩法纯化PCV2ORF2重组蛋白。将纯化的PCV2ORF2重组蛋白免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠,3次免疫后,取免疫后小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA筛选,经过3次亚克隆获得4株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,命名为1H9、4C11、5B8和4F12株。IFA和Western blot试验说明,4株杂交瘤细胞分泌的抗体能与ORF2重组蛋白作用。特异性试验表明,4F12株单克隆抗体与猪圆环病毒2型(PCV2KQ22株)发生特异性反应,经抗体亚型鉴定1H9、4C11和5B8 3株亚型为IgG1/Kappa,4F12株为IgG2b/Kappa,1H9、4C11、5B8和4F12株小鼠腹水效价分别为105、104、106和105。表明获得了与PCV2特异性作用的单克隆抗体。

猩红热监测病例分离金黄色葡萄球菌病原特征分析

目的了解猩红热样病例中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的感染情况,为非A组溶血性链球菌感染导致的咽峡炎提供病因线索。方法采集2019—2022年北京市某区猩红热监测病例的咽拭子样本373份并进行金黄色葡萄球菌分离,对分离菌株进行金黄色葡萄球菌A蛋白基因多态性(spa)分型和对12种抗生素的耐药表型检测,分析其分子特征和耐药特征。结果373份咽拭子样本中SA检出率为6.97%(26/373),男性和女性检出率分别为7.43%(15/202)和6.43%(11/171),检出率比较差异无统计学意义(χ^(2)=0.141,P=0.839);金黄色葡萄球菌的检出病例主要在20岁以下人群,<6岁、6~<11岁、11~<16岁、≥16岁4个年龄组金黄色葡萄球菌检出率分别为5.24%(13/248)、11.65%(12/103)、6.25%(1/16)和0(0/6)。分离到的26株金黄色葡萄球菌共分布10个spa型别,构成比前3位为t652(26.92%,7/26)、t309(15.38%,4/26)、t693(11.54%,3/26)和t571(11.54%,3/26)。26株金黄色葡萄球菌对PEN、TET、ERY、OXA、CFX耐药率分别为92.31%(24/26)、23.08%(6/26)、19.23%(5/26)、7.69%(2/26)和7.69%(2/26),分布9种耐药谱,优势耐药谱为PEN单独耐药(50.00%,13/26),其次为PEN+TET联合耐药(19.23%,5/26)和PEN+ERY联合耐药(7.69%,2/26)。多重耐药率为11.54%(3/26)。结论北京市某区猩红热监测病例中金黄色葡萄球菌检出率较高,分离株spa分型分布多样但在短期内呈现一定聚集分布特征,且不同年份具有不同的优势型别。金黄色葡萄球菌分离株对PEN处于高耐药水平而对OXA和CFX处于较低耐药水平。

单克隆抗体标志乳胶凝集试验快速检测金黄色葡萄球菌及其耐药性

目的探讨金黄色葡萄球菌(SAU)的细菌学快速检测鉴定及其耐药性分析的试验方法。方法目标菌落先经传统鉴别方法怀疑葡萄球菌,采用Slidex MRSA Detection乳胶快速检测SAU菌株青霉素结合蛋白2a(PBP2a),确认耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA);设立SAU耐苯唑西林筛选试验对照,两组不符合菌株经PCR方法检测MceA基因确认。结果456株葡萄球菌中Slidex(staph.plus乳胶凝集法阳性(鉴定为SAU)135株,135株凝集法阳性菌中最后确认为SAU 127株,321株凝集法阴性菌最后确认为SAU11株,乳胶凝集法鉴定金黄色葡萄球菌灵敏度92.0%,特异性97.5%;Slidex MRSA Detection乳胶快速检测138株SA的PBP2a,阳性52株,138株SAU经苯唑西林筛选试验及PCR测定mceA基因,确定MRSA57株,乳胶凝集法快速检测SAU的PBP2a确定MRSA,灵敏度91.2%,特异性100%。结论单克隆抗体乳胶凝集法快速检测SAU及鉴定MRSA,具有较高灵敏度和特异性。